Name: Bradford蛋白含量的线性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学习Bradford蛋白定量线性化方法以提高检测准确性和灵敏度。本实验通过590nm和450nm双波长吸光度比值计算，显著降低去污剂干扰，适用于生物化学研究中的精确蛋白定量分析。

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本文献给已故的 Zvi Selinger 博士，以纪念他生前主持了本文所述的原始研究工作。

Bradford 蛋白质标准曲线的线性化：
考马斯亮蓝蛋白测定法，通常称为 Bradford 测定法1，因其操作快速简便且具有相对较高的灵敏度而被广泛应用。然而，在较宽的蛋白浓度范围内，该方法存在显著的曲线弯曲现象（图 1）。因此，标准曲线通常仅采用相对较窄的较高蛋白浓度范围（2–10 μg/ml BSA），此时数据更符合线性回归（图 1，绿色）。但由于非线性特性，待测样品的蛋白浓度必须落在标准曲线的有限范围内，以避免产生较大误差，同时该特性也降低了在有限范围内的测定准确性。当无法获得微克级蛋白样品时，这种非线性问题尤为严重，通常需要对待测样品进行多次稀释。
正如 Bradford 原始论文中所述：“非线性现象的来源在于试剂本身，因为染料两种不同颜色形式的光谱存在重叠。”1 事实上，在通常的酸性 pH 条件下进行检测时，考马斯亮蓝染料存在三种酸碱平衡形式2。红色、蓝色和绿色形式的吸收峰分别位于 470、590 和 650 nm（图 2）。其中蓝色形式可与蛋白质结合，形成在 594 nm 处强烈吸收光的复合物3,4（图 2）。Bradford 还指出：“随着越来越多的染料与蛋白质结合，试剂的背景值持续下降”1（图 3）。因此，我们尝试通过测定在 450 nm 处的吸光度变化（该波长下蛋白质-染料复合物不吸收光），来计算随着蛋白质量增加，590 nm 背景信号的降低程度。我们发现，背景信号的下降仅部分解释了非线性现象，但并非全部原因（图 4）。
我们随后推测，游离染料浓度的降低会导致线性响应的另一种偏差，因为蛋白质-染料结合处于平衡状态5，复合物的形成不仅取决于游离蛋白质的浓度，还取决于游离染料的浓度（图5）。考虑到与游离染料浓度变化相关的这两个因素，我们建立了一个数学方程，用于描述蛋白质浓度与590 nm和450 nm处吸光度比值之间的线性关系（图6）。该理论与实验研究的详细描述可参见我们1996年发表在《Analytical Biochemistry》上的文章6。该数学方程经过实验验证，在整个蛋白质浓度范围内均能产生线性校准曲线（图7）。此外，该方程还通过独立测定Y轴截距的正确pH依赖性数值得到了验证6。
使用微孔板吸光度读数仪改进的 Bradford 蛋白质测定详细实验方案：
<ol>
	<li>配制0.1 mg/ml的牛血清白蛋白标准品储备液。也可选择其他标准品，但需注意在所有实验中必须使用同一种标准品。</li>
	<li>将未知样品用去离子水稀释。目标为5-50 μg/ml然而，蛋白质浓度较高或较低均可接受，因为该检测方法的线性范围无明显限制。但测量值必须处于吸光度读数仪的线性范围之内。</li>
	<li>将 Bradford 试剂（Bio-Rad）用去离子水稀释 2.5 倍。</li>
	<li>加入0和10-50 μl 将BSA储备液加入三份孔中（形成0-5 μg BSA 标准曲线）。用去离子水补足至 100 μl/well.</li>
	<li>在不同的孔中加入 100 μl 未知样品需设三个重复。可使用未知样品的多个浓度以提高检测准确性。</li>
	<li>添加 100 μl 向所有孔中加入稀释后的Bradford试剂。总体积为 200 μl/well.</li>
	<li>等待显色至少 5 分钟，但不超过 60 分钟。</li>
	<li>空白 必须 是 200 μl 去离子水（以及 不 零蛋白染料孔</li>
	<li>在 590 nm 和 450 nm 处测定吸光度。</li>
	<li>通过计算590 nm和450 nm处的净吸光度值的比值绘制标准曲线。注意应将零蛋白（仅染料）的数值作为数据点纳入（图8）。</li>
	<li>根据标准曲线的线性方程（图 9）计算未知样品的浓度。</li>
</ol>
代表性结果：
与在单一590 nm波长下的吸光度不同，590 nm与450 nm吸光度的比值与蛋白质浓度呈线性关系（图10）。
未知样品的蛋白质浓度可直接利用标准曲线的线性方程（图10，方程）计算得出。
然而，通过测量多个未知样品稀释液可以获得更高的准确性。为此，需绘制两张图。第一张为标准品的校准曲线图，横轴为蛋白质含量（单位：μg）（图11，右）；第二张为未知样品的曲线图，横轴为原始未稀释样品的体积（单位：μl）（图11，左）。两个图中均应包含染料空白值（图11）。未知样品的蛋白质浓度通过将未知样品曲线的斜率除以标准品曲线的斜率计算得出（图11，公式）。
<img alt="BSA吸光度分析，标准曲线图；590 nm处的吸光度与BSA浓度（µg/ml）的关系。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 传统的Bradford标准曲线图。线性范围由绿色符号表示。
<img alt="蛋白质-染料复合物的吸收光谱；考马斯亮蓝；光谱分析图" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 蛋白质-染料复合物与游离染料的光谱。
<img alt="静态平衡；ΣFx=0；相互作用图；演示粒子平衡；力的分解。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3. 蛋白质-染料平衡。
<img alt="显示净吸光度与BSA浓度关系的蛋白质测定图，包含线性及空白校正。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 正确计算的背景校正可部分降低非线性。
<img alt="显示化学平衡方程 K_eq=[DP]/[D][P] 的化学平衡图；蛋白质相互作用研究。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5. 蛋白质-染料平衡。
<img alt="静态平衡方程；用于光谱拟合的Σ；公式分析；A590/A450 比值；Y=aX+b。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6. Bradford 蛋白质测定法线性化的数学基础。
<img alt="BSA标准曲线；吸光度比值与浓度；线性回归；R²=0.9995；检测分析。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7. Bradford标准曲线的线性化。
<img alt="BSA浓度分析图表，590/450 nm吸光度数据，蛋白质定量结果。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图8. 吸光度比值的计算。
<img alt="吸光度与牛血清白蛋白（BSA）的线性回归图；方程 Y=0.353X+0.434，R²=0.999。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 9"> 
图9. Bradford 法线性标准曲线图。
<img alt="用于BSA浓度分析的590 nm处吸光度及吸光度比值的光谱图。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 10"> 
图10. Bradford标准曲线图的线性化。
<img alt="蛋白质定量图谱及方程；裂解液与 BSA 吸光度比较，显示线性结果。" src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 11"> 
图 11. 未知样品浓度计算。

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

Bradford 蛋白质测定法因其操作简便且具有相对较高的灵敏度而广受欢迎。本方案所获得的整个蛋白质浓度范围内的线性化结果进一步简化了该测定法，因为待测样品无需落在标准曲线的范围内。
重要的是，改进后的方案相较于原始 Bradford 方案还具有以下优势：
<ol>
 <li>提高准确性。</li>
 <li>灵敏度提高了约一个数量级，使得在微孔板检测中可测定低至 50 ng BSA 的蛋白量6。</li>
 <li>灵敏度的提升使得在含有去垢剂的情况下仍可进行蛋白质定量。在原始 Bradford 方案中，细胞裂解常用的去垢剂通常会干扰检测，导致对蛋白质的响应信号减弱。灵敏度提高一个数量级后，样品可被稀释至去垢剂干扰完全消除的程度。请注意，标准品应含有与待测样品稀释后相同种类和浓度的去垢剂。</li>
</ol>
蛋白质-染料复合物和游离红色染料的吸收峰分别位于594 nm和470 nm。建议在590-600 nm处测定吸光度，以获得对蛋白质浓度变化的最大灵敏度；在450-485 nm处测定，以确保...

<table><tbody><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

bradford 蛋白质测定法的线性化

Linearization of the Bradford Protein Assay

考马斯亮蓝Bradford法通过测定590 nm处的吸光度来定量微克级蛋白质含量。该方法是最常用的蛋白质定量技术，可用于细胞裂解液、细胞组分或重组蛋白样品中的蛋白质定量，以实现生物化学测量的标准化。然而，该方法存在固有的非线性问题，影响其灵敏度和准确性。研究表明，在标准测定条件下，590 nm与450 nm处吸光度的比值与蛋白质浓度呈严格线性关系。这一简单改进使检测的准确性和灵敏度提高约10倍，最低可定量至50 ng的牛血清白蛋白。此外，新方案显著降低了常用于制备细胞裂解液的去污剂所带来的干扰。基于质量作用定律和比尔定律建立的线性方程能够完美拟合实验数据。

通过快速便捷的考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量时，其准确性和灵敏度会因固有的非线性而受到影响。本文展示了一种简单的线性化方法，可显著提高检测的准确性，使灵敏度提升约10倍，并大幅降低去垢剂的干扰作用。

Bradford 蛋白质测定法的线性化

考马斯亮蓝布拉德福德法通过测定590 nm处的吸光度，实现对微克级蛋白质含量的定量。

Bradford 蛋白质测定实验首先在 96 孔板中加入梯度增加的 BSA 标准品以及未知样品的稀释液，并加入去离子水以补足各孔体积的差异。随后，除空白孔外，向所有孔中加入 Bradford 试剂，空白孔必须只加水。五分钟后，在 590 纳米波长处测定蛋白-染料复合物的吸光度，同时在 450 纳米波长处读数。为了使图形线性化，590 纳米与 450 纳米处吸光度值的比值与蛋白质含量呈严格线性关系。大家好，我来自以色列特拉维夫大学生物化学系，我是来自实验室的 T。今天我们将向您展示一种利用改进的线性化 Bradford 方法测定蛋白质浓度的操作流程。我们在实验室中使用此步骤对SZaS中的蛋白质含量进行归一化处理，例如在上样凝胶前。现在我们开始吧。在Bradford分析中，考马斯亮蓝染料的三种形式在通常的酸性pH条件下处于酸碱平衡状态。红色、蓝色和绿色形式的吸收峰分别位于475、590和650纳米。其中蓝色形式可与蛋白质结合，形成在594纳米处强烈吸收光的复合物。这种被广泛使用的测定方法在较宽的蛋白质浓度范围内具有较大的曲线弯曲度。因此，仅使用相对较窄的高蛋白浓度范围来绘制校准曲线，从而更适用于线性回归。造成非线性的原因之一是游离染料在590纳米处的吸光度，随着蛋白量的增加，该吸光度会下降。通过在450纳米处测定吸光度变化，可在一定程度上减小非线性，因为在该波长下，染料本身会吸收光，而蛋白-染料复合物则不会。通过减去正确计算的空白值，游离染料浓度的降低会导致线性响应的另一种失真，因为蛋白质与染料的结合处于平衡状态，复合物的形成不仅取决于游离蛋白质的浓度，还取决于游离染料的浓度。考虑到与游离染料浓度变化相关的这两个问题，已推导出一个数学方程，该方程描述了蛋白质浓度与590纳米和450纳米处吸光度测量值之比之间的线性关系。该数学方程经过实验验证，在整个蛋白质浓度范围内均能产生线性校准曲线。首先，配制浓度为 0.1 毫克/毫升的标准牛血清白蛋白茎溶液。也可选择其他标准品，但需注意在所有实验中必须使用同一种标准品。将未知样品用去离子水稀释。目标浓度为每毫升5至50微克，但可接受更高或更低的蛋白质浓度，因为该检测方法的线性范围无明显限制。但需注意，测量值必须处于吸光度读数仪的线性范围之内。同时将 Bradford 试剂用去离子水稀释 2.5 倍。接着，向 96 孔板的多个孔中分别加入 0 以及 5 至 50 微升的 BSA 储备液，每个浓度设三个复孔，用去离子水补足至每孔总体积为 100 微升，以制备 0 至 5 微克的 BSA 标准曲线。对于待测样品，同样取 100 微升设三个复孔，可使用多个不同浓度的待测样品以提高检测准确性。最后，向所有孔中加入100微升稀释后的Bradford试剂，每孔总体积为200微升。同时准备一个空白对照用于测定吸光度。必须使用200微升去离子水，而非零蛋白染料。孵育时间至少5分钟，但不得超过60分钟，以进行显色反应。在590纳米和450纳米处测定吸光度。空白对照需使用水。通过将590纳米和450纳米处的净吸光度值相除，绘制标准曲线。请注意，应将零蛋白浓度值作为一个数据点纳入。根据标准曲线的线性方程计算未知样品的浓度。与在单一590纳米波长下的吸光度不同，590纳米与450纳米吸光度的比值与蛋白浓度呈线性关系。未知样品的蛋白质浓度可直接利用标准曲线的线性方程进行计算。然而，通过测定多个未知样品稀释液，可获得更高的准确性。为此，需制备两张图表。第一个是标准品的校准曲线图，横轴为蛋白质的微克数。第二个是未知样品的曲线图，横轴为原始未稀释样品的微升数。两个图中均应包含仅染料的数值。通过将未知样品的斜率除以标准品的斜率，可得出未知样品的蛋白质浓度。我们刚刚向您展示了如何使用改进的线性化Bradford方法测定蛋白质浓度。采用此方法可显著提高检测的准确性，使灵敏度提高约10倍，并大幅降低去垢剂对此实验的干扰。需要注意的是，应使用水作为空白对照，而不是用零蛋白染料样品。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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