Name: 长鼻扩展响应（PER）的含量在果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 40 s
Description: 学习果蝇长鼻扩展响应实验方法，通过饥饿处理优化味觉行为检测。该视频演示了PER实验的关键步骤，包括固定果蝇、制作吸液芯和精确接触技术，帮助研究人员准确评估昆虫味觉偏好。

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感谢 Paul Graham 在视频演示中担任摄像师。

饥饿处理
<ol>
<li>首先，将果蝇进行饥饿处理。</li>
<li>在空的试剂管中放入一小块浸有水的Kim-wipe滤纸。</li>
<li>将20–30只已充分喂食的果蝇转移至该空试剂管中。</li>
<li>每12–24小时检查一次，确保滤纸保持湿润。</li>
<li>对果蝇进行36–72小时的饥饿处理。</li>
</ol>
固定果蝇
<ol>
<li>用吸虫器吸取一只果蝇。</li>
<li>将一个 200 µl 的黄色吸头套在开口处。同时翻转并轻轻吹气，可将果蝇挤入黄色吸头中。</li>
<li>轻轻吹入少量空气，将果蝇推至无法移动的位置。</li>
<li>使用刀片，在果蝇眼睛附近的位置做一标记，然后将果蝇吸回，并剪去吸头尖端。</li>
<li>轻轻将果蝇吹回原位，但在即将到达末端前，在预计喙部所在位置进行斜切。此斜切步骤可省略，但保留将使后续操作更为简便。</li>
</ol>
制备蔗糖灯芯
<ol>
<li>将一条6 mm宽的Kimwipes®纸巾卷成细线，然后撕成若干小段锥形灯芯状碎片（&lt; 1 cm）。</li>
<li>将这些小段灯芯浸入蔗糖溶液或水中，通过接触方式递送至喙器以供取食。</li>
</ol>
准备对照组和实验动物
<ol>
<li>在测试任何味觉刺激物之前，先给果蝇提供4%的蔗糖溶液。这作为阳性对照。若果蝇无反应，则弃用该个体。</li>
<li>接着，测试果蝇对dH2O的反应。这作为阴性对照。若果蝇产生反应，则弃用该个体。</li>
<li>在测试完待测味觉刺激物后，需再次进行上述对照测试。</li>
</ol>

<ol><li>Dethier, V. G. The Hungry Fly. , Harvard University Press. Cambridge. (1976).</li>
</ol>

在本演示中，我们已详细介绍吸管伸展反应实验的全部步骤。该方法听起来相当简单，但在许多其他行为学实验中，一些细微因素可能会影响实验的顺利进行。我们已经讨论了需要特别注意的多个步骤。在此，我再次强调其中一些最重要的因素。
其中一个因素是灯芯的形状。我展示了一些非常好的示例，但事实上，实际情况通常介于“非常好”和“非常差”之间，形成一个连续的谱系。刚开始时，你可能使用的灯芯接近“非常好”的一端，但随着时间推移，你的判断标准可能会逐渐向“不那么好”的范围偏移。人类对所谓“好”的感知很容易在无意识中发生改变。防止这种情况的一种方法是，将实验中使用的灯芯拍照，并将所有照片并列比较。或者至少保存一张表现极佳的灯芯照片，在进行PER测试前仔细观察一段时间。
另一个重要方面是接触的冲击程度。这一点较容易处理，因为目标是使接触尽可能轻柔。如果你完全看不到果蝇头部移动，那就是最佳情况。

饥饿条件是最难控制的因素。在许多味觉或嗅觉行为实验中，通常采用24小时的饥饿处理时间。24小时对实...

<table><tbody><tr><td>HDR-HC1</td><td>相机</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ800</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-IBSS</td><td>相机转接器</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DC10LN</td><td>相机转接器</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>257010</td><td>相机转接器</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TREKKER Mk2</td><td>三脚架</td><td>BENBO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gorillapod SLR</td><td>三脚架</td><td>Joby</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac G5</td><td>计算机</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power Mac G5</td><td>计算机</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie</td><td>软件</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPEG Streamclip</td><td>软件</td><td>SQUARED 5</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

果蝇喙伸展反应（per）实验

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

喙伸展反应（PER）是一种味觉行为检测方法，已在果蝇和蜜蜂中得到应用。
在果蝇口器（唇瓣）表面，存在称为感器（sensilla）的毛发状结构，其内含有味觉神经元。当有吸引力的物质接触到唇瓣时，果蝇会伸展其喙以摄取该物质。喙伸反应（Proboscis Extension Response, PER）实验用于测量这种味觉行为反应，是研究单只果蝇食物偏好的一种有效方法。多种糖类溶液（如蔗糖、葡萄糖和果糖）对果蝇极具吸引力。通过将厌恶性物质与甜味溶液混合，观察PER反应的减弱，也可检测其抑制效应。尽管基本操作流程较为简单，但许多因素可能导致实验失败。其中一个需要关注的因素是果蝇的反应状态。使果蝇达到合适反应状态所需饥饿时间差异显著，通常在36至72小时之间。我们建立了一系列对照，用于评估果蝇的状态，从而筛选出无反应或过度反应的个体。另一个重要因素是刺激力度以及接触唇瓣的位置，这些难以用语言准确描述。本视频展示了这些内容以及其他多项改进措施，有助于提高该方法的可重复性。

喙伸展反应（proboscis extension response，PER）是一种味觉行为检测方法，已在果蝇和蜜蜂中得到应用。当喙接触到有吸引力的物质时，果蝇会伸展其喙以摄取该物质。不同糖类溶液对果蝇具有很强的吸引力。

果蝇喙伸展反应（PER）实验

Proboscis extension response（PER）是一种味觉行为检测方法，已在果蝇和蜜蜂中得到应用。  
在果蝇口器的表面……

您好。在本演示中，我们将向您展示如何在果蝇中进行喙伸展反应（Probus extension response，PER）检测。喙伸展反应（PER）是一种味觉行为检测方法，已被广泛应用于果蝇和蜜蜂的研究中。当喙接触到具有吸引力的物质时，果蝇会伸展其喙以摄取该物质。各种糖类（如蔗糖、葡萄糖、果糖）的溶液对果蝇极具吸引力。接触果蝇的腿部也可引发伸吻反应（PR），但在本展示中，我们希望重点关注喙部的接触。因此，进行伸吻反应检测的第一步是使果蝇处于饥饿状态。优化饥饿条件是本实验中最关键的因素之一。其中有两个主要因素至关重要：一是饥饿时间，二是果蝇在饥饿前的体型大小。这两者之间似乎存在正相关关系。如果果蝇体型较大且较肥，就需要更长时间的饥饿处理。果蝇的体型取决于培养基的营养状况以及试管中果蝇的密度。让我来展示一个良好的示例。你可以看到，这个小瓶中的果蝇并不拥挤，大约有一百到一百五十只PPE果蝇。因此，一旦果蝇从这里封闭后，应将其继续饲养在新鲜培养基中3至5天，然后转移到一个装有湿润滤纸的空玻璃管中。滤纸需始终保持湿润，饥饿处理时间可为24至96小时。我们稍后将详细说明饥饿时间的设定。以下是进行果蝇PER实验的固定方法。首先，取一只果蝇和一个吸虫器。然后，在吸虫器开口处套上一个200微升的黄色吸头。现在同时进行翻转并朝其吹气。可轻轻挤压使果蝇进入黄色吸头，并施加少量气流，将果蝇推至无法移动的位置。使用刀片，在果蝇眼睛附近做一标记，然后将果蝇吸回，并剪去吸头尖端。接着轻轻吹气，将果蝇吹回原位。但在即将到达末端之前，在准备放置吻部的位置做一个SL切口。可以不进行SL切口，但如果有这一步骤，后续操作会明显更容易。现在，在果蝇下方剪去黄色的尖端，并用黏土填充底部，然后将其直立放置。可以通过在尖端添加更多黏土来进行最终调整。重要的是尽量不要用力过猛地推动钓饵。让我集中在这里，也许再稍微向上推一点。因此，果蝇的头部会略微高于此处。现在这是你在显微镜下观察时的样子，这是从侧面和正面看到的视图。现在你已准备好测试 pr。我们使用的WIC用于传递味道，其制作方法如下：使用Kim擦拭纸，将其通过粉碎机处理，形成如图所示的条状物。该条状物的宽度约为六毫米，大约五到六毫米。现在，你需要将这条带子拧转，形成一根线，要用力拧紧。我正在拧转，这样就形成了一根线，变成像这样的细线。接下来，我们用一对镊子，将这些细小的绒毛从线中拉出、分开。这就是我们如何进行清醒实验。在本视频片段中，我们将演示与果蝇（Pro Bois）接触的正确位置。我们将使用浸泡过4%蔗糖的细线，并通过触碰背腹轴上不同区域来展示其敏感性的差异。腿节的中心位置在这里，这是最敏感的区域。因此，你应该始终尝试以这种方式接触中心位置。当你触碰唇瓣最顶端或背侧区域时，果蝇不会产生反应。因此我们在此处建立了接触，但可以看到果蝇并未伸出ssis。当你触碰唇瓣的腹侧最下部时，也会出现同样的情况。这稍微有点困难，但我们来看看能否与唇瓣最下部形成良好的接触。我们将采用轻柔、再轻柔的操作方式。让我们来看看这里。我会再次触碰中心位置，以确认这只果蝇仍在其中。对甜味感兴趣。因此在舌乳头中，我们应始终触碰中心区域，即这个位于中央的部位。当你从垂直方向观察该检测时，舌乳头的中心略微向下指向这个方向。因此，当你水平接近豆荚时，也就是在这个方向、这个方向，最近的点将位于敏感区与非敏感区之间，此时会产生反应。但如果只是略高于该位置，则不会产生反应。因此，让我进行探查。现在，第一排小肠无反应，第二排无反应，第三排有反应，是的。因此，你至少需要深入到第三排小肠以下。现在让我从底部进行类似的探查。这稍微困难一些。我正在触碰从底部数第二行。现在我将上移。第三行，第四行，不，没有响应。第五行。因此，从底部算起，至少要接触第四到第五行的Sula。这意味着在操作过程中必须持续接触中心位置，否则将显著增加数据的变异程度。建议您反复练习这一操作。关键因素是从水平方向接近时，在最接近点稍下方的位置进行接触，即此处。接下来，我将向您展示唇瓣内侧区域与外侧区域在敏感性上的差异。我调整果蝇的位置，使其在本图中朝上。首先，我将触碰果蝇唇瓣的中心或内侧部分，可以看到果蝇表现出良好的反应。接下来，我将触碰位于唇瓣最外侧区域的感器，此时可以看到果蝇没有产生反应。现在，让我从侧面逐渐探查至中心位置，我正在触碰最外侧的区域。我正一点一点地向中心移动。正如您所见，一旦到达正中心，果蝇就会产生反应。让我再从侧面开始，向中心移动一次。因此，重要的是要在垂直和水平两个方向上触碰水平面的中心。在本节中，我将演示如何与 osis 进行接触。一般来说，应尽可能轻柔地完成接触。判断刺激效果的一个良好指标是果蝇头部的运动反应。理想的触碰应完全看不到头部向后移动。另一个重要因素是灯芯的形状。我将展示一些例子。此处灯芯的形状非常好，既不太厚，也不太薄。如果太厚，就难以实现精确接触，且冲击往往更大；如果太薄，则无法确定溶液是否已正确输送至尖端，这种情况比太厚更糟糕。让我用这个触碰唇部几次。在那里、那里、那里，接触时几乎看不到任何头部移动。有时你会得到一个看起来像这样的灯芯，其尖端部分明显太细。你无法确定尖端上的浓度是否是你想要递送的浓度。因此，你可以使用这些黄色尖端部分，像这样将其折叠几次，通过这种方式，可以将其塑造成这种理想形状，让我来与这个接触一下。这样你就可以看到，头部的移动几乎看不到了。这里有一点髋部的移动，但没错，这是另一个很好的例子。只要能够实现精确而轻柔的接触，并不一定总是要舍弃较厚的切片。这些切片仍然可以使用。头部的移动幅度可能比细的稍大一些，但只要手保持稳定，仍然可以实现像这样良好的接触。这种光纤不应该使用，因为有太多纤维散开，难以将其捆扎在一起。应丢弃这些并另找一个。这个也不合适。吸头过细且过短，无法向下折叠以形成更粗的吸头。而周围部分过厚，无法实现精确接触，这些也应一并丢弃。这个问题载玻片的问题在于其表面液体过多，难以实现精确接触。这会在玻棒上留下较多液体，从而可能干扰后续操作。即使使用了吸水性很好的棉芯，若未轻柔接触，效果也不理想。以下是一个错误示例。你可以看到果蝇的头部正在剧烈移动。强烈的冲击会使果蝇对某种物质的反应受到抑制，并且果蝇很容易对后续的品尝行为失去兴趣。接下来，我想提供一些减少这种冲击的建议。首先，在灯芯即将接触黄尖之前，将其停在上方。通过这种方式，您可以观察到此时手部抖动的幅度。通过观察这一点，您可以预判最后接近的距离，移动灯芯，使手抖动的最远点能够到达羊皮纸的凹陷处。当然，如果没有手抖的情况会更好。但这种方法允许你对其进行操作，并能降低整体影响。我们注意到的一个现象是，即使让果蝇运动相同的时间，由于饥饿时间不足，仍会得到一批对任何刺激均无反应的果蝇。或者，你可能会发现一整批果蝇全部死亡。因此，无论果蝇的实际状态如何，仅根据固定的饥饿时间来测试果蝇是不明智的。这会使数据的变异性大大增加，甚至可能掩盖你所关注的现象。为了改善这一情况，我们将介绍一系列用于评估果蝇状态的对照实验。第一步是检测阳性对照的伸吻反应（PER），即使用4%蔗糖。该浓度足以诱导果蝇产生反应。对于大多数星虫蝇而言，如果蝇类对这一阳性对照无反应，则意味着该蝇可能需要更长的饥饿时间，或因受伤等其他各种原因而处于不活跃状态。因此，必须弃用这些蝇类。若其确实产生了反应，则尝试进行阴性对照实验，即使用水。如果果蝇对水有反应，这意味着它们处于口渴状态，或者它们对所有刺激都有反应，又或者它们已被训练成对任何接近的物体都产生摄食行为。这是由于我们在此处提供的阳性对照物质具有吸引力。果蝇已学会将接近的物体识别为可能是甜味的。因此，我们试图测量的是味觉行为，而非学习行为。你不希望前一次试验因学习效应而影响后续试验。而当使用较高浓度作为阳性对照时，对阴性刺激产生反应的可能性似乎会增加。现在，您可以使用任何物质或条件来测试果蝇的伸吻反应（PER），但在测试结束后，您需要再次进行阳性和阴性对照实验。因为如果果蝇在此时对阳性刺激没有反应，说明它在测试过程中可能已经对刺激物失去兴趣，那么您将无法判断其在测试中无反应究竟是由于对该特定刺激缺乏反应，还是由于整体兴趣下降所致。接下来，如果果蝇对阴性对照产生反应，则表明该果蝇可能已处于口渴状态，或已对靠近的物体形成条件化反应。而只有当果蝇对阴性对照无反应时，您最终获得的数据才是可靠且可用于累积分析的。因此，这个时间窗口通常持续大约5到10至15分钟。在某些情况下，我发现这个时间窗口可持续长达30分钟。一段时间后我们意识到，这是海星时间与死亡率之间关系的图示。因此，横轴表示时间，纵轴表示试管中存活果蝇的百分比。果蝇最终会开始死亡，且个体间差异较大。我意识到的一点是，在达到某个特定时间点之前，果蝇对阳性对照均无反应；但在此之后，会突然开始出现对阳性对照产生反应的果蝇。当然，随着时间的推移，你可以继续使用它。但从某个特定时间点开始，我们发现会有越来越多的果蝇对阴性对照产生反应。因此，你需要把握住这一时间范围，以便进行电生理记录（ERs）。因此问题在于，这种情况何时会发生？根据我的经验，在条件非常好的情况下，通常在36到48小时左右发生，但有时也可能长达72小时，实际时间变化很大。因此，你最好准备多个样品管并进行设置，以便能够捕捉到这个短暂的时间窗口。再次强调，即使饥饿时间相同、食物相同，其他所有条件也都相同，这一现象仍存在很大差异。因此，即使是在相同或极为相似的遗传背景下，这种差异仍然显著。这一点正是您需要特别注意的。我们讨论了那些被刺激条件化的果蝇，它们现在会对任何刺激产生反应。防止这种情况的一个方法是不要反复给予吸引性的味道，并在实验中穿插阴性对照。让我来演示一下具体操作方法。因此这是一个阳性对照。此处为4%蔗糖，我们在这里给予了两次。如果持续给予这种甜味物质，反复多次，最终会产生条件反射。现在，我们将加入一个阴性对照。如您所见，它不会对阴性对照产生反应。让我再操作一次。第一个阳性对照，4%蔗糖。让我稍微弯曲一下。再次出现非常强烈且迅速的恢复反应。现在，我们再次进行阴性对照。让我们看看，这里不太理想，让我把它翻转一下。好的，这里。这是阴性对照水。可以看到，阴性对照不会产生响应。现在让我展示一个不理想的例子。因此，我们提供的是8%蔗糖，这比我们使用的阳性对照浓度更高。果蝇非常喜欢，会主动趋向。让我、让我重新试一下。让我们看看这里轻柔的接触。它正在非常主动地寻找目标，其突起结构仍处于延伸状态。因此，让我们等待一段时间，然后再在该位置建立另一次接触。哦，那里。所以还在找，是的，还在找。在找它。确保一下，是的，仍然没问题。再试一次，再一次，再一次。哦，有了，是的，反应非常强烈。现在，我们不再使用8%的蔗糖，而是改用阴性对照。那么，让我们把这根灯芯放在这里。这根灯芯稍微太细了。让我把它折叠起来，形成一个漂亮的阶梯状。但这是水。因此你可以看到，在这种情况下，果蝇会对水产生反应。在这个示例中，我们给予了五次非常有吸引力的物质。但这并不意味着两次是可以的，而五次就是有害的。在很多情况下，果蝇仅通过一次4%的甘油刺激，甚至更低浓度、更低剂量的刺激，就能形成条件化反应。重要的是要尽量减少有吸引力物质的重复施加次数。如果需要使用一系列浓度的有味道物质，更安全的做法是从低浓度开始，逐步提高浓度，同时尽快撤除味道，以使果蝇无法大量摄入，从而减少果蝇的条件化反应。大家好，在本次演示中，我们已经详细介绍了伸吻反应实验的全部步骤。该方法本身听起来相当直接，但与其他许多行为学检测一样，一些细微之处可能会影响实验的成功。我们已经经历并总结了多个需要特别注意的关键步骤。在此，我想再次强调其中一些最重要的因素。首先是灯芯的形状。我展示了一些非常理想的示例图片，但实际上，所有情况都会落在从极好到极差的连续谱系中。在初期，你可能使用的是处于非常理想范围内的灯芯，但随着时间一天天过去，它可能会逐渐发生变化。您可能正在使用的那些周数，可能会逐渐进入不理想的范围。而人类对于所谓“好”的感知，在没有察觉的情况下很容易发生偏移。预防这一问题的方法之一，是拍摄一张效果非常好的 WIC 图像，并在测试 P 之前查看该图像。第二个重要因素是冲击力。这更容易处理，因为最佳的接触或撞击，是完全看不到头部移动的接触。因此，如果能将接触做到尽可能轻柔，并且看不到果蝇的头部有任何偏移，那就是最佳状态。现在来看饥饿条件，这是第三个因素，而饥饿条件是最难控制的因素。在许多味觉行为实验或嗅觉行为实验中，常采用24小时的饥饿处理，因为这一时长对实验人员而言操作较为方便。但如果果蝇在非常良好的条件下培养，24小时的饥饿时间则相对较短。即使使用营养丰富的果蝇培养基并精确控制果蝇密度，该实验处理的时间窗口仍可能在36至72小时之间变化。现在。因此，作为一个实验，我必须指出，对人类或研究人员来说进行这个实验是非常不方便的，而且还有另一个因素使得实验者面临更大的困难。事实上，会有许多批次的实验窗口可能非常短暂，甚至可能根本不存在。因此，你必须克服一些主要的障碍。但最重要的是阳性对照和阴性对照。通过严格遵循这些标准，您将能够获得可靠的数据集。

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