利用动物帽移植（ACT）实验进行组织决定研究 Xenopus laevis

ACT 检测的总体目标是验证目的基因是否能够决定原始外胚层向特定细胞命运分化。该实验流程首先在发育中的 Xenopus laevis 胚胎中过表达编码荧光报告基因以及目的基因的 RNA。下一步是分离表达过量 RNA 的动物极帽或原始外胚层组织，并将其培养至 15 期。

该实验步骤的第三步是去除15期宿主胚胎侧 flank 部位的组织。最后一步是将供体动物帽组织的一半移植到宿主胚胎的 flank 部位，并将宿主培养至42至43期。结果通过切片及组织特异性标志物的免疫染色显示，形成了异位组织，例如类似眼睛的结构。

您好，我是来自纽约州立大学上州医学院眼科系的 and sine。今天我将向您展示一种我们称之为动物帽移植实验的方法，该方法是我与 Mike Suber 合作开发的。我们两个实验室都使用这一实验来研究足以促进眼睛形成的基因。

那么，让我们开始吧。首先，准备用于注射的帽状RNA，转录noggin或其它目的基因以及YFP作为示踪剂。同时准备好MMR基础溶液、8倍浓缩的产卵溶液以及用于胚胎注射的针头。

使用定制的弹性体模具制作胚胎固定培养皿。通过微波炉熔化1% AROS与0.4 XMMR的混合液，为每种实验条件制备一块注射板。将约六毫升该溶液转移至60毫米的培养皿中。

将弹性体模具轻轻放置在溶液上以防止产生气泡，并静置冷却约20分钟。在室温下，为每种实验条件制备一个盖片隔离板，使用1% AGROS加0.7 XMMR，并采用与上述注射板相同的方法和模具。为每个时间点准备额外的平板。

有关计算时间点的详细信息，请参阅配套的书面实验方案。接下来进行分离。取自雄性青蛙的组织进行检测，并将组织置于含有 50 微克/毫升庆大霉素的 1 倍 XMMR 无菌溶液中，在 4 摄氏度下保存。

此操作可在实验开始前一周内进行，但需注意精子的活性会随着时间推移而下降。在显微注射前一天傍晚，给雌鱼注射500单位的人绒毛膜促性腺激素。将雌鱼在16至18摄氏度下过夜放置。

现在所有准备工作已完成，可于次日进行显微注射。首先移出经激素诱导的雌鱼，将其分别放入含有一个 XELS 的独立鱼缸中。通过剪断尖端来准备显微注射用的针头。

为了获得25至35微米的直径，将针头安装到PLI 100皮升注射仪上，并校准使其每次注射量为10纳升。将培养箱温度设置为14摄氏度，在注射RNA后将胚胎置于该较低温度下，可减缓胚胎发育，从而在一次实验中完成更多移植操作。在受精前约一小时，从鱼缸中取出卵子。雌鱼产卵后，再等待一小时，使用移液器将新产的卵子从鱼缸中移出。

注意不要使用在ELS溶液中存放超过两小时的卵。由于卵的质量会下降，应将卵放入60毫米的培养皿中。每个培养皿中的卵呈单层排列，约占培养皿面积的80%。

尽可能去除卵中的ELS，并替换为一份XMMR。卵子可在一份XMMR中保存长达一小时。随后使用匀浆化的睾丸组织对卵子进行体外受精。

最好在上午11:00、中午12:00和下午1:00左右分三批对胚胎进行受精，以便使其发育至所需阶段：用于帽分离的8.5至9期，以及用于移植的15期。卵子受精后一小时，使用D型琼脂溶液去除卵子的胶状包被，并用大量0.1 XMMR溶液洗涤，然后等待受精卵发育至二细胞期。

开始分选。准备一个注射皿，其中加入含有6% Ficoll的0.4 XMMR溶液。当胚胎发育至两细胞期时，使用转移移液管将色素分布均匀且分裂均等的胚胎分选至注射皿的孔中。

将显微注射用的第一拉针尖端置于60毫米培养皿盖顶部。用移液器吸取2微升RNA样品并滴加到薄膜上，然后吸取。使用皮升注射仪填充注射针。

在开始注射前，务必确认针头仍能释放 10 升样品。将 RNA 注射到两个处于双细胞期的胚胎中。每个胚胎注射 500 皮克的 Y-F-P-R-N-A，每次注射 20 至 30 个胚胎，并置于一个培养皿中。

另取20至30个胚胎，每个注射20皮克的Nain RNA，该RNA已与Y-F-P-R-N-A预先混合，注射后放入培养皿中。此外，每次实验时间点另取100至200个未注射的胚胎，置于含有FICO溶液的另一个注射皿中。将这些胚胎与注射过的胚胎同时移入和移出培养箱。

这些是用于注射后移植菌盖的宿主。将所有胚胎在14摄氏度下过夜培养。对所有计划的时间点重复此操作。

经过过夜培养后，可分离动物极帽。请于次日一早到达实验室对胚胎进行分期。同时记得将未注射的宿主胚胎从培养箱中移除。

最早的取样时间点应在第九阶段。首先剔除未存活的胚胎。随后从存活的胚胎中分离动物极帽组织，将每个时间点的胚胎分批处理，转移至动物极帽分离培养皿中。

加入足量的 0.7 XMMR 加庆大霉素溶液。然后将每块含有已注射胚胎的培养皿中的培养液倒出，并重新加入 0.7 XMMR 加庆大霉素溶液。使用移液器将胚胎从注射用培养皿的孔中轻轻吹下，并转移至 freshly prepared cap isolation dish 中。

使用装有黄色尖端且弯曲至400微米的胃部操作器，或使用一对锋利的5号镊子，在0.7 XMMR加庆大霉素溶液中分离动物帽。保留两到三个完整的胚胎用于分期。分离动物帽后，将其与宿主胚胎一同放回14摄氏度的培养箱中，直至次日将动物帽移植到宿主胚胎的侧 flank 部位。

从14摄氏度培养箱中取出第一个时间点的帽状体和宿主胚胎，根据荧光阳性情况对胚胎进行分期，并筛选出荧光阳性的帽状体。计数帽状体数量并移除。使用尖头5号镊子将宿主胚胎数量加倍转移至新制备的注射皿中，注射皿内含0.7 XMMR加庆大霉素溶液。

从每个宿主胚胎上移除Lene膜。将它们转移到带有盖子的培养皿中，但需注意在没有Lene膜的情况下小心操作。可使用装有黄色吸头、顶端带有200至250微米弯曲金属丝（调至最高档位）的胃部操作仪，或使用5号镊子，使胚胎在水面迅速解离。

在14至15期的胚胎侧面移除一个200微米见方的区域。然后再次使用gastro master或5号镊子，将组织切成两半，并将其放入宿主胚胎的切口中。

将胚胎在孔中轻轻转动以促进愈合。在胚胎处于15期时，尽可能对所有胚胎进行此操作。对所有时间点重复该步骤。

胚胎通常在30分钟内愈合。使用5号镊子，以轻柔的刷动动作去除呈白色的死亡细胞。将移植后的胚胎在18摄氏度下培养过夜。

经过过夜孵育后，在解剖荧光显微镜下操作，筛选出移植组织带有荧光标记的胚胎。将选中的胚胎重新置于18摄氏度环境中继续培养至第42至43期。当动物达到目标发育阶段时，用三卡因麻醉，并在荧光解剖显微镜下观察并拍照。

移植后的胚胎可进行固定、切片和免疫染色，或使用特定组织的标记物进行原位杂交。以下是一例移植后一天的宿主蝌蚪的代表性结果，其中供体组织表达荧光示踪剂和noggin。请注意组织在蝌蚪侧面聚集成团的现象。

接受仅表达荧光示踪剂的受控供体组织的宿主胚胎，已开始将动物帽细胞整合到其体侧。数天后，接受表达 nain 的供体细胞的蝌蚪在体侧形成类似眼睛的结构，而接受对照供体组织的蝌蚪则在皮肤表面具有荧光细胞。我们刚刚向您展示了如何在爪蟾（Zaps Lavis）中进行动物帽移植实验。

进行此检测时，重要的是要记住提前准备好当天所需的一切，以免胚胎发育速度超过您处理的速度。就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。