视频人类胚胎干细胞克隆生长的生物信息学分析

本方案通过分析在配备摄像装置的 Icon Bio Station CT 培养箱中采集的时间序列视频，演示了一种用于测量人胚胎干细胞（HESC）集落生长的视频生物信息学方法。人胚胎干细胞（HESC）集落在培养至70%汇合度后重新接种，并在培养箱中继续孵育48小时，随后在Biot ct系统中对HESC集落进行额外48小时的摄像。通过使用CL-Quant软件开发的分割增强与测量流程，确定其生长速率。

这些方法通过与 Adobe Photoshop 进行比较来验证，Adobe Photoshop 是一种图像分析工具，能够对每个菌落进行精确的手动掩膜拟合。视频生物信息学这一新兴领域可用于自动处理、分析和挖掘显微视频中的生物数据。大家好，我是 Serena Lin，来自加州大学河滨分校细胞生物学与神经科学系 Prou Talbot 博士的实验室。

大家好，我是来自塔尔博特实验室的 Sean Fino。大家好，我是来自细胞分子与发育生物学研究生项目的 TI Satish。今天我们将向您展示如何使用视频生物信息学工具来测量人类胚胎干细胞集落的生长情况。

我们在实验室中采用此方法来检测环境毒物对人类胚胎干细胞行为的影响。我们将在新的干细胞核心实验室中演示该方法。现在让我们开始。

为进行视频分析而准备人胚胎干细胞（HESC），需将HESC在基质胶包被的六孔板中培养至70%融合度。从一个含有HESC的孔中吸除培养基，并用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两次。加入一毫升Accutase酶溶液，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育一分钟。随后，向孔中加入10至12颗玻璃珠，轻轻摇动培养板，直至细胞集落完全脱落。

使用1毫升人胚胎干细胞维持培养基或小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中和Accutane。将未附着磁珠的细胞收集至15毫升锥形管中，在200 ×g离心3分钟。弃去上清液，加入500微升新鲜的人胚胎干细胞维持培养基或M-TeSR，将100微升人胚胎干细胞悬液逐滴接种至多个12孔Matrigel包被板的孔中。

轻轻前后摇动培养板，并在光学显微镜下观察，确保细胞团块均匀分布在各孔中。将培养板置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育48小时，以确保细胞充分贴壁并充分铺展，便于清晰观察。孵育48小时后，吸除培养基，用500 µL PBS洗涤各孔，以去除未贴壁的细胞，随后每孔加入500 µL M-T-E-S-R培养基。

立即将培养板放入Biot CT中，并开始采集延时图像。应选择含有独立单菌落的视野，避免菌落之间相互生长融合。在本方案中，细胞将被连续录像48小时，每7分钟采集一次图像帧。

首先，手动浏览整个视频，确认其中包含一个在记录期间始终保持清晰对焦的单一菌落，以创建分割方案。完成此步骤后，在 CL quants 软件中打开分割向导，然后点击“下一步”按钮。选择正确的图像通道，再点击“下一步”按钮。

选择软匹配并点击下一步。通过从菌落外缘画圈至中心区域，选取一个或两个目标区域。该区域应尽可能小，但需具有整个菌落的代表性。

不要选择过多区域，否则可能导致掩膜应用不准确。单击下一步按钮。通过圈选出不属于菌落也不属于背景的区域来选择不需要的区域。

这些区域存在应被抑制的模式，例如碎片和死细胞。点击下一步。通过圈选非菌落、碎片或死细胞的区域来选择背景。

背景应均匀，并且很可能出现在每一帧中。通常，我们选择菌落周围的灰色背景。点击下一步按钮。

如果掩膜未能准确覆盖目标区域，则应在该区域上显示彩色掩膜。若需要调整掩膜，可增加或减少屏幕右下角的分割阈值范围。选择以更新软匹配区域。

这允许更改需要或不需要的区域以及背景区域。如果掩膜效果满意，请选择应用阈值并保存我的掩膜，然后单击下一步按钮。

随后，掩膜将以不同的颜色显示。选择“完成”。该方案应作为分割方案显示在软件右上角。

如有需要，可通过右键单击并输入新名称来重命名该实验方案。要应用该实验方案，请右键单击并将鼠标悬停于其上。

应用预设。此时将出现一个菜单，允许选择要使用的帧数。将帧间隔设置为每20帧一次，以确保掩膜的保真度。

随机手动抽查应用了掩膜的 10% 帧，以创建一个消除碎片中非目标区域的增强方案。右键点击增强方案文件夹，然后点击新建。应从原始视野中显示一个新的增强方案。

将鼠标悬停在工具栏的图标上，找到位于图像右侧的切换增强模块按钮，然后单击该按钮。选择标注下拉菜单，选择“标注连接的二”。

应显示一个新的任务栏。从分割流程中获取初始掩膜，并将其拖动到输入框中。此时任务栏应显示输入掩膜的编号。

将带有输入掩膜编号的图标拖动到掩膜零图标上。在任务栏中找到最小尺寸并调整数值，直到仅显示感兴趣区域。每次拟合试验时，务必点击执行。

当最小尺寸调整达到满意效果后，点击屏幕底部的上一个增强方案，选择“保存至方案”。软件将提示是否覆盖所选方案，选择“是”以确认保存。使用与斑点检查分割相同的步骤来检查增强方案。

如果对分割和增强方案满意，请继续创建测量模板。首先，在右侧工具栏中选择“创建测量模板”。在测量窗口中，选择将光标移至剪贴画细胞图像上。

按住控制键并选择形态学部分下方的细胞，取消勾选默认参数，勾选面积参数。然后退出模板窗口。选择该图标。

创建测量方案。重命名该方案。切换至模板选项卡，在右上角将先前创建的测量模板拖放到测量窗口中。

在测量方案窗口中点击“是”继续，选择通道映射，然后选择全细胞掩模映射。接着选择全细胞选项；为增强掩模，请在方案选项卡下选择相应的测量方案。

在主窗口中，选择测量方案窗口内的保存图标。然后关闭该窗口，接着关闭并重新打开视野。右键单击方案列表文件夹，然后依次将所需应用的方案拖入方案列表中，选择锁定方案列表，并使用 Adobe Photoshop 对视频数据依次运行这些方案。

分析相同菌落的每第20帧。在 Adobe Photoshop 中手动打开一幅菌落图像的帧。单击工具栏中的魔棒工具。

点击菌落周围的区域，使整个视野都被覆盖，除了菌落本身所在区域。确保菌落周围的虚线恰好贴合菌落的边缘，而不是位于菌落内部。如果虚线未贴合菌落边缘，请相应调整上方工具栏中的容差值。

在工具栏中单击快速蒙版模式下的编辑，然后单击菌落以选中该菌落。转到窗口，下拉菜单中单击直方图。缓存应设置为1。

如果缓存为2，请点击表达标记感叹号，将缓存更改为1。将像素值记录到电子表格中。对每第20帧重复上述过程。

使用 Photoshop 和 CL quant 软件收集的数据可被共同绘制成图。我们用于量化人胚胎干细胞（HESC）集落生长的方案，展示了视频生物信息学在生物学问题中的一个应用。此处我们展示了一张图表，比较了使用 CL quant 软件和 Adobe Photoshop 测定的 48 小时内集落大小的增加情况。

该图展示了五个不同的菌落，每个菌落均通过两种软件包进行分析。每个菌落以不同的颜色表示。实线数据来自sail quant软件的分析结果，而虚线数据则来自Photoshop的分析结果。

原始数据图显示，两种测量方法在考虑菌落起始大小不同的情况下具有良好的一致性。该图将数据重新绘制为菌落大小的百分比增长。无论菌落的起始大小如何，生长速率均相似，且两种分析方法得出的结果相近。

下图展示了人类胚胎干细胞集落生长的先前百分比变化数据的均值。该图清楚地表明，使用视频生物信息学方法与Adobe Photoshop进行的分析结果具有良好的一致性。我们刚刚向您展示了如何使用视频生物信息学工具来测量人类胚胎干细胞集落的生长情况。

使用相差显微镜进行此操作时，务必包含菌落周围的晕圈，以确保软件能够精确选择菌落。还需注意，可采用其他培养、孵育和视频采集方法替代本实验所展示的方案。一旦完成配方的开发与验证，其分析速度将显著快于人工分析，且实验变异性更小。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。