Name: 利用磁调制生物传感系统的生物检测的快速均质检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 了解磁调制生物传感系统用于白细胞介素-8的快速均质检测方法。该技术利用磁珠振荡和荧光标记实现高灵敏度检测，无需洗涤步骤，适用于生物分子分析和生物传感应用。

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本工作部分由 Ishaya Horowitz 基金资助。

IL-8 检测：
<ol>
 <li>反应体系总体积为 100 μl，包含以下四种组分，各组分在检测缓冲液中的终浓度如下：10 μl 偶联捕获抗体的磁珠（终浓度为 100 个/μl），2 μl 生物素化 IL-8 抗体（终浓度为 1 纳克/μl），1 μl 链霉亲和素荧光蛋白（终浓度为 20 纳克/μl），以及 1 μl IL-8 目标物（终浓度为 0.48 皮克/μl）。将各组分依次加入检测缓冲液中，随后振荡反应 30 分钟。</li>
 <li>对照反应以相同方式制备，但不加入 IL-8 目标物。</li>
 <li>反应完成后，无需进行分离或洗涤步骤，直接将反应液转移至比色皿中，使用 MMB 系统进行检测。</li>
</ol>
MMB 系统：
<ol>
 <li>将比色皿放置在两个电磁极之间的位置。</li>
 <li>开启调制电流，等待30秒以使磁珠发生聚集和凝聚。</li>
 <li>使用示波器测量锁相放大器的信号。</li>
</ol>
代表性结果：
对聚集的微珠进行肉眼观察，发现有靶标与无靶标的反应之间存在明显差异。在所有含有靶标的反应中，微珠形成单一且致密的聚集体，以协调一致的方式进出激光束。然而，在所有不含靶标的反应中，微珠的聚集程度较低，其运动也较不协调（见图1）。
<img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig1.jpg" alt="光谱分析；瞬态吸收光谱展示分子激发过程及实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1：夹心式免疫测定法的目视检查（a）无目标物IL-8；（b）含有目标物IL-8。
在检测0.48皮克IL-8靶标时，图1(a)展示了极调制时钟信号（黄色）和光电倍增管（PMT）输出信号（洋红色）。每个极的调制频率为2 Hz。然而，正如理论预期，当微珠通过激光束时，PMT检测到荧光信号，PMT输出电压出现峰值。因此，解调频率为4 Hz。当PMT信号和倍频调制时钟信号（4 Hz）输入至锁相放大器时，灵敏的相位检测器检测到同步信号，并输出高电压（见图2）。
<img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig2.jpg" alt="极性调制时钟和PMT信号、锁相放大器电压、图形、时间与电压分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2： (a) 检测0.48皮克IL-8靶标时的调制时钟信号（黄色）和PMT信号（品红色）。(b) 两次不同扫描下得到的锁相放大器电压结果。
当检测对照样品时，锁相放大器未检测到任何信号。这一事实结合在聚集性上的视觉差异表明，MMB系统能够明确识别IL-8靶标的存 在。

<ol><li>Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fluorescent-labeled+probes+at+sub-picomolar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation.</a> Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).</li>
<li>Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+homogenous+detection+of+the+Ibaraki+virus+NS3+cDNA+at+pico-molar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+%22Human+angiogenesis+assay+panel%22%22">Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel"</a>. , Bio-Plex Pro. Forthcoming.</li>
<li>Instruction Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Plex+Precision+Pro+Cytokine+Assay%22">Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay</a>. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.</li>
</ol>

综上所述，我们证明了MMB系统可用于检测低浓度IL-8靶标（Bio-Plex Precision Pro细胞因子检测方法的检测限为0.5皮克[3,4]）。该系统的应用能力不仅限于IL-8，还可用于检测其他蛋白质。MMB系统的优点在于能够快速检测靶标，且无需任何分离或洗涤步骤。因此，该系统简化了检测流程，便于在野外环境中应用。

<table><tbody><tr><td>人细胞因子IL-8 Bio-Plex Pro检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>171-B5008M</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-8靶标</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>R202625</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的单克隆小鼠抗人IL-8抗体G265-8</td><td>BD Biosciences</td><td>554718</td><td></td></tr><tr><td>与荧光蛋白偶联的链霉亲和素</td><td>Bio-Rad</td><td>Streptavidin PE</td><td></td></tr></tbody></table>

基于磁调制生物传感系统的生物检测快速均相检测方法

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

一种磁调制生物传感系统（MMB）[1,2] 能够在无需任何洗涤或分离步骤的情况下，快速且均匀地检测低浓度的生物靶标。当存在 IL-8 靶标时，基于“夹心”结构的检测方法会通过 IL-8 靶标以及生物素标记的 IL-8 抗体，将连接有 IL-8 捕获抗体的磁珠与链霉亲和素偶联的荧光蛋白结合。通过在两个电磁极之间施加交变磁场梯度，使磁珠产生振荡运动。与磁珠相连的荧光蛋白被富集到检测区域，其进出正交激光束的运动产生周期性荧光信号，该信号通过同步检测技术进行解调。此前，磁调制生物传感系统已被用于检测伊巴拉基病毒非结构蛋白3（NS3）互补DNA（cDNA）的编码序列[2]。本文所展示的对外部颗粒的操控与富集技术也可应用于其他领域，例如磁耦合药物的递送。体内或增强对比度以体内成像应用。

磁调制生物传感系统可用于快速、灵敏且简便地检测生物样本，例如DNA分子和蛋白质。

一种磁调制生物传感系统（MMB）[1,2] 能够在无需洗涤或任何标记的情况下，快速、均匀地检测低浓度的生物靶标。

磁调制生物传感（MMB）是一种用于检测生物分子的新型技术。在此展示了一种原理验证实验，当将白细胞介素八（也称为 IL-8）加入含有抗体包被磁珠的反应混合物中，并进一步加入抗 IL-8 抗体和荧光标记的链霉亲和素后，可检测到白细胞介素八的存在。该方法形成一种分子夹心结构，有效地将荧光分子与磁珠连接在一起。将反应置于涡流仪和交变磁场中。通过两个电磁极施加梯度，使磁珠产生振荡运动。磁珠带动其上连接的荧光蛋白周期性地进出正交激光束，从而产生荧光信号，该信号由光电倍增管（PMT）收集并进行解调。使用锁相放大器，可以通过CCD相机观察到微珠的运动，替代了PMT。在磁性微珠通过白细胞介素8与荧光蛋白连接的样品中，可观察到同步运动。大家好，我是来自特拉维夫大学物理电子学系非线性光学与激光实验室的Adia。我是来自伊利诺伊大学芝加哥分校生物科学系的NoGo。我是来自特拉维夫大学细胞研究与免疫学系的Marcelo Erlich。今天，我们将向您展示一种利用磁调制生物传感系统进行生物检测快速均相检测的方法。我们在实验室中使用该方法来检测低浓度的特定蛋白质和DNA序列。现在就开始吧。开始实验前，为每个反应设置并标记一个离心管，包括目标样本和非目标对照样本。向每根离心管中依次加入 Bio-Plex Precision Pro 细胞因子检测试剂盒的以下组分：偶联磁珠的检测抗体、IL-8 抗体、链霉亲和素-PE 和 IL-8 目标物。用检测缓冲液将总体积调至 100 微升（µL），然后在小型轨道摇床上振荡反应 30 分钟。样品在室温下振荡30分钟后，直接转移至比色皿中进行分析。使用MMB系统时，用镜头清洁纸和70%乙醇清洁透明比色皿。用于分析的仪器包含一个488纳米倍频激光器，作为激发光源，通过562纳米二向色镜将光束导入显微镜物镜。显微镜物镜将激光聚焦于一根400微米宽的BO硅酸盐玻璃管内，形成直径为27微米的光束束腰。发射的光通过两个连续的带通滤光片进行光谱过滤，由光电倍增管（PMT）探测，并使用锁相放大器进行解调。采用自制的电流调制器，将方波依次输送至每个电磁铁。振幅应为1.4安培，频率为1至6赫兹，因为磁珠在每个周期内会两次进入和离开激光束。锁相放大器的解调频率为2至12赫兹。通过将488纳米激光器的钥匙转至开启位置并接通电源来启动系统。然后将激光功率调至最低，大约四到六毫瓦。打开示波器，接着打开光电倍增管（PMT）。接下来将样品置于两个电磁极之间。使用vete的旋转平台，确保激光束穿过vete，且不触及vete的壁面。利用vete的XY、Z平移平台，调节其相对于物镜和电磁极的位置。为了优化荧光信号向探测器的耦合效率，应将vete置于电磁极连线稍靠后的位置。现在将示波器设置为时间轨迹测量模式。将光电倍增管（PMT）增益控制调节至0.5伏。接着打开电流调制器电源，并将频率设置为3赫兹。等待30秒，使磁珠发生聚集和浓缩。磁珠将开始振荡并移向管的前端。当激光束照射到振荡的磁珠时，应可见磁珠反射出的激光闪烁光。请注意，当电流调制增大时，磁珠移动加快；当电流调制减小时，磁珠移动变慢。可通过使用千分尺控制的载物台来调节磁珠在管中的位置。为了移动磁极，可将CCD相机置于原本PMT的位置，以观察磁珠的运动。示波器检测来自荧光偶联微珠的周期性信号，并记录示波器的时间轨迹。保存的数据可使用 MATLAB 进行分析。通过 MMB 检测含有和不含 IL-8 的反应混合物。在所有含有靶标的反应中，微珠形成单一的致密聚集体，该聚集体与激光束同步进出。然而，在没有目标物的情况下，磁珠的聚集程度较低，其运动也较为分散。图中黄色显示的是两赫兹下各磁极的相位调制时钟，品红色显示的是光电倍增管（PMT）输出信号，二者共同反映了每个磁极的调制频率。因此，解调频率为四赫兹，与理论预期一致。当微珠通过激光束时，光电倍增管（PMT）会检测到荧光信号，当PMT信号与双重调制时钟信号输入至锁相放大器时，PMT输出电压会出现峰值。高电压结果来自灵敏的相位检测器的同步作用。两种颜色表示在相同目标浓度下进行的两次不同扫描。黑线表示每个信号的平均值。当检测对照样品时，锁相放大器未检测到任何信号。此种情况下，锁相放大器未提供任何锁定信号。这一事实，结合聚集体在形态上的视觉差异，表明MMB系统以及PMT输出信号的时间轨迹测量结果的差异能够明确识别ILH靶标的存​​在。我们刚刚向您展示了如何利用磁调制技术快速、均一地检测生物分子，以白细胞介素-8（IL-8）为例进行生物传感。进行此操作时，重要的是要牢记遵守激光安全规程。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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