Name: 脑室下区恩的脸:Wholemount染色和室管膜流量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T16:22:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: 学习制备小鼠侧脑室壁整体装片技术，用于研究神经发生和脑脊液流动。该方法通过免疫染色和荧光微珠示踪，揭示室管膜细胞活动及神经干细胞行为，为成年哺乳动物大脑再生研究提供重要工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目HD-32116、Sandler家族支持基金会、John Bowes干细胞基金、文部科学省（MEXT）、厚生劳动省（MHLW）以及人类前沿科学计划（HFSP）支持。Z.M. 由Carlos Baldoceda基金会和加州大学旧金山分校（UCSF）Krevans奖学金资助。A.A.-B. 担任Heather和Melanie Muss特聘讲席教授。

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<li>Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+organization+of+neural+stem+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain.</a> Science. 317, 381-384 (2007).</li>
<li>Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+stem+cells+are+heterogeneous+with+respect+to+their+embryonic+origins+and+neurogenic+fates+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb.</a> J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).</li>
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<li>Kohwi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+olfactory+bulb+GABAergic+interneurons+is+derived+from+Emx1-+and+Dlx5%2F6-expressing+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors.</a> J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).</li>
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</ol>

大多数关于脑室区和室下区神经发生的研究依赖于传统的切片技术，以观察这些区域的微细解剖结构和细胞间关系。本文介绍一种替代性技术，该技术最初用于分析室下区（SVZ）产生的成神经细胞迁移链网络1，随后被用于研究抗有丝分裂治疗后SVZ前体细胞群体的再生6，最近则被用于研究成年SVZ神经干细胞精确的顶端和基底细胞间相互作用2,3,4。有趣的是，该技术揭示成年SVZ的神经干细胞（即B1型细胞）与已分化的非分裂性室管膜细胞共同构成一种混合性神经上皮。通过整体标本的表面成像发现，这种混合性神经上皮具有“风车样”结构，即B1型细胞的顶端末端被室管膜细胞较大的顶端表面所包围4。这种表面分析方法深化了我们对胚胎和成年脑中神经干细胞谱系的理解，即这些细胞具有位于脑室表面的顶端末端，并通过基底突起与血管微环境相接触。这些发现若采用传统切片技术几乎无法实现。整体标本还有助于通过神经干细胞与脑室相接触的顶端突起来识别这些细胞。随着针对这些干细胞更特异性标记物的发现，整体标本技术将成为识别和分析神经干细胞行为不可或缺的一部分。
侧脑室壁的整体装片也为研究室管膜细胞的平面极性提供了理想视角。室管膜细胞是多纤毛细胞，排列于脑室表面，其功能是以协调的方式推动脑脊液流动。通过整体装片技术，可完整暴露整个室管膜上皮的表面，从而能够从其前到后、背侧到腹侧边界进行全面的染色与研究。此外，在急性分离的活体整体装片上进行的室管膜流动实验，可强有力地展示由室管膜纤毛产生的平面极化流动。近期利用整体装片方法的研究已揭示了这种室管膜平面极性的细胞决定因素5。有趣的是，整体装片研究还提示，室管膜产生的脑脊液流动建立了化学排斥物的梯度，从而引导脑室下区（SVZ）新生神经元的迁移7。因此，最初用于发现迁移性神经元链网络的整体装片方法，正在持续为揭示调控链式迁移的机制提供新的见解。
通过整体成像对脑室区（VZ）和室下区（SVZ）进行分析，为未来的研究提供了一种新方法，同时也为澄清现有研究的理解提供了途径。例如，最近一项研究提出，成年SVZ中的神经干细胞是与脑室接触的CD133+/CD24-细胞8。基于他们在组织切片中的免疫染色结果，这些作者声称这些细胞是多纤毛室管膜细胞的一个亚群。然而，在我们采用整体成像方法的研究中，由于该方法能够更全面地观察整个室管膜上皮，我们发现所有室管膜细胞均表达CD24，而唯一表现为CD133+/CD24-并与脑室接触的细胞是B1型细胞的一个亚群4。此外，整体成像技术有望在今后研究成年大脑中神经干细胞最近被描述的镶嵌式组织结构时发挥重要作用9。多项研究表明，成年大脑中的神经干细胞并非均一的细胞群体，而是具有区域特异性，通常仅产生特定亚型的嗅球中间神经元。这些研究提出，不同亚群的神经干细胞可能通过特异性转录因子的表达10,11,12,13,14和/或其在侧壁背腹向及前后向区域的定位差异加以区分9,15,16。随着更多用于标记成年神经干细胞区域特异性亚群的分子标志物被鉴定出来，整体成像技术应能提供一个全面的视角，揭示这些不同前体细胞区域沿脑室壁的分区分布情况。
本文介绍的整体解剖与成像技术也可用于分析胚胎中的脑室壁。胚胎侧壁的解剖以相同的步骤逐步进行，仅在操作难度上略有差异：胚胎脑室相对较大，使解剖更为容易，但组织较软，导致操作更为困难。特别是，在胚胎中可通过类似的侧脑室暴露方法来解剖脑室的皮质壁，以研究皮质神经发生。近期证据表明，在皮质神经发生过程中，中心体的不对称遗传可维持放射状胶质细胞位于脑室表面17。对放射状胶质细胞顶面进行正面成像，可能有助于揭示这些分裂细胞中中心体如何实现不对称遗传。
与大多数技术一样，尤其是涉及精细操作的技术，熟练掌握需要练习。然而，在解剖过程中有几点关键因素有助于获得更好的结果：1）照明——调节样品的光照以产生阴影，可在原本相对均一的组织解剖过程中提供极为宝贵的对比度；2）使用镊子如同使用两根昆虫针——本技术中从不用镊子夹捏或提起组织，而是将其作为可灵活移动的固定针，能够在切割过程中持续调整以稳定组织；3）轻柔牵拉与切割之间的平衡——刀具不仅用于切割，还应提供轻柔的牵拉以分离内侧壁与外侧壁，需记住，该解剖过程主要依靠轻柔牵拉完成，仅间歇性地进行切割。

脑室下区的表面观：整体染色与室管膜液流

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

侧脑室壁含有成年哺乳动物大脑中最大的生发区域。这些脑室壁中的室下区（SVZ）是研究神经干细胞行为及成年神经发生调控机制的广泛采用的模型系统。传统上，此类研究依赖经典的组织学切片技术。本文介绍一种替代方法——全组织染色技术，可提供该生发区域完整且正对的视野。与切片相比，全组织标本能更好地保留SVZ内的完整细胞结构及细胞间的空间关系。该方法最近揭示，成年神经干细胞（即B1型细胞）与分化成熟的室管膜细胞共同构成混合性神经上皮，排列于侧脑室表面。此外，该技术已被用于研究室管膜细胞的平面极性及其在脑室内驱动的脑脊液流动。随着越来越多证据表明成年神经干细胞是一个具有区域特异性的异质性细胞群体，全组织染色技术有望成为解析这一干细胞微环境组织结构与区域划分的关键工具。

关键词：室下区，神经干细胞，成年神经发生，全组织染色，室管膜细胞，B1型细胞，侧脑室，干细胞微环境

侧脑室壁包含成年哺乳动物大脑中最大的生发区域。传统上，对该区域神经发生的研究依赖于经典的组织学切片技术。本文我们介绍一种替代方法——全脑组织铺片技术，该方法可对这一生发区域提供全面的、表面观的视野。

侧脑室壁含有成年哺乳动物大脑中最大的生发区域。这些脑室壁中的室下区（SVZ）是一个……

大家好，我是扎曼。我是 Arturo Alvarez-Buylla。今天我们来到 Arturo 的实验室，这里隶属于神经外科系以及埃利·埃迪斯·布罗德再生医学与干细胞研究中心，我们将向您展示如何制备侧脑室壁的整体封片标本。这些整体封片可用于固定后的免疫染色，也可作为活体样本用于分析纤毛流。Mann 今天将向你们展示的这种整体封片技术，是多年来在实验室中发展并完善起来的，旨在研究侧脑室壁的完整结构，包括纤毛细胞以及位于脑室下区的生发活性——该区域正是神经干细胞所在的位置。该技术最初由 Fiona Dutch 建立，随后由 HIE Victor 和 Casu Moto 进一步优化。它们都不再位于实验室中。以下示意图展示了如何制备侧脑室侧壁的整体封片。首先将脑组织分为两个半球。在后部进行冠状切开以暴露海马体，此处以紫色显示其横截面。随后将覆盖海马体并以紫色显示的内侧壁从外侧壁上剥离，外侧壁覆盖着散在的齿状回，并以粉色显示。两个壁将像打开一本书一样被分开，内侧壁将被切除，仅留下暴露的外侧壁。本视频的第一部分介绍了整体解剖操作，但这可能并非实验的第一步。从时间顺序上讲，如果计划分析房水流动，请参考书面实验方案以获取详细信息。每次解剖前，务必确保所有工具均已灭菌并放置在手边。在荧光解剖体视显微镜下放置一个含有37°C L-15培养基的6厘米解剖皿，并将新鲜解剖获得的小鼠脑组织置于体视显微镜下的解剖皿中。使用精细镊子剥离嗅球。使用刺切刀将脑分为左右两个半球。在其中一个半球的后端进行冠状切面切割。为了暴露海马的索状部分及其横切面，将刺切刀插入皮层与海马之间的小脑室腔隙，切割以分离皮层与海马背侧的连接处。在角落处切除一块楔形皮层，并用精细镊子缓慢将其从海马上剥离。继续剥离环绕至海马腹侧边缘的皮层部分。使用解剖刀从皮层腹侧分离海马体。用解剖刀和精细镊子将海马体从皮层中轻轻拉出。小心向前推进，避免损伤脑室壁。两个壁应彼此向外打开。像用刀切开一本书一样，切掉悬垂在侧壁上方的皮层部分。为了在牵拉阻力增大时更好地显露此表面，还需进行两次额外的切口。一个位于背侧，即内侧壁与外侧壁相接处，另一个类似的切口位于腹侧。使用刺刀刀具进行短小的切割操作。这些附加切口可使内侧壁进一步向后牵拉，从而暴露脑室的前部。调整光照，使阴影显现出内侧壁与外侧壁之间的交界处，形成类似两壁之间山谷的形态。使用刀片精确地沿此“山谷”切开，去除丘脑及任何悬垂的皮层组织。应立即使用孔膜进行纤毛流分析。如果需要对孔膜进行解剖以进行免疫染色，可在完成一个样本后立即将其浸入固定液中，如此可一次性解剖多个孔膜。视频的下一部分将演示如何检测由室管膜细胞纤毛产生的液体流动。使用荧光微珠。首先用两枚昆虫针将新鲜解剖的侧壁组织孔状熔融样本固定在解剖皿中。然后将装有荧光微珠的玻璃微量移液管尖端缓慢降至整体封片样本表面，在时间序列成像的同时，轻柔地将荧光微珠沉积于样本表面。视频记录了附流实验中微珠的运动。在进行整体解剖前，应按照本方案文字部分所述制备玻璃微量移液管。制备完成的移液管应具有平滑、缓和的锥形末端，以及45度斜面，内径约为100微米。通过毛细作用将矿物油吸入移液管，填充至约一半位置。将蘸有真空脂的推杆插入移液管后端，然后推进推杆，使油的弯月面移至移液管尖端。将带有柱塞的移液管固定在可调节臂的显微操作器上。通过前端装填法将移液管吸入含有50%荧光微珠、5%甘油和45%水的溶液。按前述方法新鲜解剖一个孔状组织样本，并将其脑室面朝上转移至盛有37°C生理环境的清洁解剖皿中。使用Leitz培养基，用两枚昆虫针将孔式固定装置固定在解剖皿中，一枚插入丘脑，另一枚插入前背侧皮层。将固定臂支架的底座置于体视显微镜旁，保持固定臂处于抬高位置，以避免损坏微移液针头。将微移液针的尖端浸入装有培养基的离心管中，以清洗附着在针头外表面的微珠。注意不要损坏吸头。将移液器的吸头置于侧壁外侧表面的背侧上方，并降低机械臂，使移液器吸头刚好位于组织表面的上方。聚焦于包含孔板前半部分的视野，并开始记录所需图像。使用活塞将约五升微珠排出至孔板表面。当初始的微珠团块被冲刷流从表面清除后，再使用活塞每次排出额外的五纳升微珠。可通过录制的视频分析流动、方向和速度。本视频的最后一部分演示了如何对角膜组织进行免疫染色并将其固定在载玻片上，用于共聚焦成像。新鲜解剖获得的角膜组织首先转移至24孔板中，并通过浸泡于多聚甲醛中进行固定。随后依次进行一抗孵育、洗涤、荧光标记的二抗孵育，以及中间的洗涤步骤。染色后，将整装组织进行次级解剖，仅分离出包含室下区的侧壁薄层，使之与含有下方的纹状体层和皮层的其余部分分开。将这片薄而扁平的组织转移至载玻片上，加盖盖玻片以固定整装组织，用于免疫染色。将组织置于含有4%多聚甲醛和0.1%Triton X-100的24孔板中，冰上孵育。在化学通风橱中，将解剖好的孔板组织切片腹侧朝上轻轻浸入培养板的一个孔中。在4°C条件下固定过夜，吸除固定液，使用移液管小心地用含0.1% Triton X-100的1×PBS缓冲液清洗孔板组织切片，每次5分钟，共洗3次。所有液体操作步骤中，均应沿孔壁轻柔加样，避免翻转孔板组织切片或损伤组织。加入含有 Triton X 和 10% 正常山羊血清的封闭液，其中 Triton X 浓度最高可达 2% XPBS，具体浓度取决于抗体渗透深度的需求。将完整样本在封闭液中于室温孵育一小时，随后移除封闭液。加入用封闭液稀释的一抗，于4°C孵育24或48小时，具体时间取决于靶抗原；用含吐温X-100的一次磷酸盐缓冲液（1×PBS）快速冲洗两次，随后在室温下每次20分钟，共洗涤三次；加入用封闭液稀释的二抗，于4°C孵育，孵育时间与一抗相同；洗涤方式与一抗洗涤相同。接下来的步骤演示如何从整个样本中仅解剖出侧壁，并将其作为单一的扁平样本进行处理，以便后续进行高分辨率成像。在体视显微镜下，将免疫染色的孔板样本腹面朝上放回盛有一倍磷酸盐缓冲液（XPBS）的洁净解剖皿中，并从后部向前部操作。使用刺切刀去除背侧皮层及下方的白色胼胝体，以暴露脑室下区与纹状体之间的界面。随后，在整个样本的腹侧做一条长的水平切口。使用精细镊子将组织放置在新的平直边缘上，使背侧朝上。室下带是一条均匀呈粉红色的薄带状组织，而纹状体则被白质纤维束浸润。将镊子作为两个固定针插入纹状体 AUM 中，以固定组织，同时避免损伤脑室壁。从前方开始。使用刺刀小心地在纹状体与室下区之间开始切割。保持切口与脑室表面平行，并维持所分离组织的厚度，这一点非常重要。随着室下区向后逐渐变薄，需小心去除孔板上不属于室壁的所有周围组织。孔板的厚度应均匀，介于200至300微米之间。使用镊子从下方轻轻提起组织薄片，并将其转移至显微镜载玻片上。加入封片剂，然后盖上盖玻片，注意避免产生气泡。将载玻片平放在载玻片盒中，于 4°C 保存一至两天，以使盖玻片在成像前充分稳定。以下是整体封片免疫染色和附着流式分析的一些代表性结果。第一张图像为整体封片染色的低倍镜视野，显示双皮质蛋白（double cottin），该蛋白是神经母细胞的标记物，可示踪成年脑室下区迁移的新生神经元链状网络结构。接下来是另一个低倍视野下的孔板切片图像，其中KI 67以绿色染色，血管以红色显示，高倍镜下可清楚观察到室下区细胞分裂活动与血管系统之间密切相互作用的最新描述。下一张图片为室管膜表面的共聚焦图像，绿色染色显示了沿脑室排列细胞的顶端表面β-catenin标记轮廓，这些细胞的基底体则以红色γ-tubulin标记。最后一张高倍图像为全片GFAP染色共聚焦层扫的最大投影图像，展示了SVZ型B1细胞的长GFAP阳性基底突起，用于分析脑室表面脑脊液流动的方向与速度。可以将鞭毛流动视频中的连续帧合并为单幅复合图像。这些复合图像显示了单个微珠在穿越鞭毛或表面时，于不同时刻所处的位置。以下是完整结果的示例。您刚刚学习了如何制备侧脑室侧壁室下区的全层组织切片。这种方法能够完整展示整个侧壁的结构，多年来已促成多项重要发现，包括观察到该脑室区域以广泛的通路网络形式组织，支持细胞的链式迁移。此外，该方法还使我们能够研究脑脊液如何流经此侧壁，并间接提示了这些细胞如何通过这一庞大通路网络引导自身迁移的机制。最近，该技术使我们发现室下区以轮状结构组织，其中干细胞位于这些轮状结构的中心，揭示了该结构内干细胞的光学末端。由于整体封片能够提供室管膜区的完整视野，其所呈现的视角是切片无法提供的；基于这一优势，我们将其公开提供给所有研究者，相信它将在许多其他研究中发挥重要作用。在制备整体封片时，有几个关键要点需要牢记，这些要点将有助于提高解剖操作的质量。第一，要确保适当的照明，调整光源使孔座上产生阴影，这样可以增加对比度，帮助你确定切割位置。第二，使用镊子作为两个可移动的固定针。不要用镊子挤压或提起组织，而应将其用作两个可移动的固定针，在切割时固定组织。第三点是结合使用常规牵拉和切割技术。正如您在解剖过程中所注意到的，实际进行的组织切割非常少。大部分解剖操作是在解剖的第二轮过程中通过常规牵拉完成的，当您将侧壁从整个标本的其余部分剥离时即是如此。最重要的是，切面方向应与心室表面的平面平行。这将确保侧壁从前往后具有均匀的厚度。同时也能保证在进行共聚焦高分辨率成像时，所有图像都能在同一焦平面上清晰聚焦。希望本视频对您的学习有所帮助。祝您的实验顺利成功。

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脑室下区恩的脸：Wholemount染色和室管膜流量

神经回路在功能区室中具有拓扑性组织，并具有特定的分子特征。本文提供了利用一种通用的全脑免疫组织化学染色方法揭示全脑拓扑结构的实用与技术步骤。我们以小脑经典的细胞构筑和神经环路为例，展示了该方法的应用价值。...

揭示复杂脑部拓扑结构的全脑免疫组织化学染色法

本文描述了一种将钙离子指示剂染料加载至脑室下区（SVZ）细胞以记录钙活性的方法。出生后的脑室下区包含紧密排列的细胞，如神经前体细胞和成神经细胞。与浴式加载不同，我们通过压力将染料直接注入组织内部，从而实现更佳的染料扩散效果。...

制备用于钙成像的急性侧脑室下区脑片

利用磁共振成像（人类）、3D成像软件以及免疫组织化学分析，我们记录了大脑侧脑室的变化。随后在小鼠模型中模拟人类大脑因衰老或疾病引起的侧脑室体积的纵向3D图谱变化，以及脑室周围细胞变化的特征。...

人和小鼠侧脑室的三维建模及室周组织的组织学表征

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

本文介绍了一种基于显微镜的实验方案，用于利用小鼠脑自由漂浮切片对神经血管单元和血脑屏障进行高分辨率成像及三维重建。该方法可实现对血脑屏障处细胞内细胞器的可视化、分析与定量。...

高分辨率共聚焦成像观察血脑屏障：成像、三维重建与转胞吞作用的定量分析

本实验方案的目的是从无脑回和有脑回的脊椎动物中枢神经系统的多个区域中分离微血管。...

跨五个脊椎动物类群的中枢神经系统微血管可靠分离

本文介绍了一种在猪小脑延髓池中直接植入导管的逐步操作方案。<br...

直接在猪的枕大池内植入导管

本方案描述了一种高效且可重复的小鼠脑组织学研究方法，包括灌注、脑切片、游离漂浮免疫染色、组织贴片和成像。...

小鼠脑组织的游离免疫染色

冷冻切片显微切割技术可对小鼠大脑中最大的神经发生微环境进行新鲜冷冻制备，用于深度定量蛋白质组学分析。该方法精确、高效，且对组织扰动极小，因此非常适用于研究该微环境以及其他器官、区域和物种的分子微环境。...

成年小鼠室管膜下区冷冻切片显微解剖用于精确深度定量蛋白质组分析

脉络丛（CP）是神经科学中一个研究尚不充分的组织，在中枢神经系统的健康与疾病中发挥着关键作用。本方案描述了一种用于分离脉络丛的显微解剖技术，并介绍了利用扫描电子显微镜获取其细胞结构整体图像的方法。...

小鼠脉络丛的显微解剖与整体封片扫描电镜可视化

本文详细介绍了从活体大鼠脑组织中分离神经干细胞和少突胶质前体细胞的方法。该方法可在不损害动物健康状况的前提下，从同一动物多次采集这些细胞。...

从活体大鼠中分离神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞的“脑乳法”

学习制备小鼠侧脑室壁整体装片技术，用于研究神经发生和脑脊液流动。该方法通过免疫染色和荧光微珠示踪，揭示室管膜细胞活动及神经干细胞行为，为成年哺乳动物大脑再生研究提供重要工具。

脑室下区的表面观：整体染色与室管膜液流

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