Name: 溶质直接气管滴入小鼠肺 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: 学习小鼠气管内滴注技术，将溶质直接输送至肺泡区域，用于研究肺部液体清除和呼吸生理。该方法可精准靶向远端肺组织，为呼吸系统疾病研究提供可靠的实验手段。

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本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）K99 HL09222601 基金以及授予 MNH 的 S&amp;R 基金会 Ryaji Uneo 奖项的支持。

1. 麻醉
<ol>
<li> 使用异氟烷麻醉小鼠可能有助于在腹腔注射麻醉剂前对动物进行操作和固定。然而，吸入性麻醉剂可能并不适用于所有研究：在开展肺部相关研究前，应首先评估使用异氟烷或其他麻醉剂可能带来的影响。</li>
<li> 使用异氟烷对动物进行麻醉。视频中展示了将异氟烷挥发罐腔室设定为2%异氟烷与氧气混合的使用方法。若无异氟烷专用腔室，也可采用标准的开放式滴加暴露技术。将大鼠置于钟形罩（或其他合适的无孔容器）内，底部装有金属网。在金属网下方放置一块纱布垫，并滴加体积分数为30%的异氟烷丙二醇溶液。使用金属网可确保动物不会直接接触浸有异氟烷的纱布垫，从而避免皮肤刺激和潜在的过量麻醉。短时间暴露后，动物应已进入麻醉状态，当倾斜钟形罩时不再出现翻正反射，且脚趾受到夹捏刺激后无反应。</li>
<li> 通过腹腔注射赛拉嗪与氯胺酮混合液对小鼠进行进一步镇静。（进行腹腔注射时，回抽确认针头未刺入肠道或其他重要器官是良好的操作规范。）将150 μL赛拉嗪（100 mg/mL）与1000 μL氯胺酮（100 mg/mL）溶于8850 μL的0.9%无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。对小鼠的给药剂量约为每10克体重80 μL。最终剂量为赛拉嗪10 mg/kg和氯胺酮100 mg/kg。应保持动物干燥并做好保温，以防止体温过度散失。可涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。</li>
</ol>
 2. 手术区域准备
 <ol>
<li>对将进行手术切口的区域进行剃毛，可防止未消毒区域的污染物进入。可使用电动剃刀将动物体表的毛发紧密剃除。剃毛范围应大于手术切口区域。</li>
 <li>随后使用脱毛膏（如Nair）可去除残留的所有毛发。在手术区域涂抹一层厚厚的脱毛膏，保留3分钟。用湿润的毛巾擦去毛发和脱毛膏。脱毛膏停留时间不得超过10分钟。</li>
 <li>使用70%酒精或其它替代性消毒液对手术区域进行无菌准备。</li>
 </ol>
 3. 手术步骤
 <ol>
<li>将麻醉后的动物置于倾斜的手术板或成角度的固定架上。</li>
<li>在颈部前侧（喉部区域）做一个小切口。</li>
<li>分离颈阔肌和气管前肌，以暴露并接触到气管环。</li>
<li>通常，气管内注射剂量为每克体重3 μl（最终体积约为30–75 μL）。使用带有30号、5/16英寸针头的1 mL皮下注射器，注入适量的灌注液。持注射器时针尖斜面朝上，并与气管平行，将全部灌注液体注入气管内。</li>
<li>灌注溶液进入肺部后，动物可能会出现喘息反应。通过注射器注入空气并观察肺部是否扩张，也可验证插管操作是否成功。</li>
<li>从气管中取出注射器。</li>
</ol>
4. 缝合。
<ol>
<li>使用持针器夹住针的针柄（即缝线材料所连接的针最粗部分）。</li>
<li>根据皮肤厚度，将针尖以90°角刺入皮肤，进针点距离伤口边缘约1-3 mm。针穿过组织后，用持针器夹住穿出的针体。采用单个打结的单纯缝合线可有效关闭伤口。</li>
</ol>
5. 动物恢复
<ol>
<li>动物应在 3-24 小时内完全从麻醉和手术过程中恢复。</li>
</ol>
6. 代表性结果
通过气管内灌注荧光化合物Cy5.5标记的葡聚糖，可观察到荧光化合物成功灌注至B6小鼠肺部（图1）。该荧光染料主要靶向肺组织，且分布均匀。操作后立即在胃肠道中观察到荧光信号，表明操作过程中意外地将导管插入了食管（图2）。研究者还可通过在操作后充气肺部并制备肺组织切片（2；3）或固定后的组织学样本，来验证化合物是否靶向递送至肺部，并检查灌注物的分布情况。
<img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig1.jpg" alt="小鼠成像，活体荧光，解剖结构可视化；光学示踪剂分布分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 荧光染料Cy5.5信号与X射线图像在成功灌注的小鼠肺组织中共同注册。将1.4 mg Cy5.5标记的葡聚糖（浓度为10 μg/μL）经气管灌注至B6小鼠肺部。使用675 nm激发滤光片和695 nm发射滤光片检测Cy5.5信号。
<img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig2.jpg" alt="荧光成像；小鼠模型；光学研究；发射分析；实验结果" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 荧光信号与X射线叠加图像在灌注不良小鼠中的共定位。在气管灌注过程中若误将导管插入食管，会导致Cy5.5进入肠道。

<ol><li>Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+instillation+as+an+exposure+technique+for+the+evaluation+of+respiratory+tract+toxicity%3A+uses+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations.</a> Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).</li>
<li>Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+epithelial+sodium+channels+examined+in+alveolar+type+1+and+2+cells+patch-clamped+in+lung+slice+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue.</a> J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).</li>
<li>Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+activates+amiloride-sensitive+sodium+channels+in+alveolar+type+I+cells+in+lung+slice+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).</li>
<li>Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+extracellular+cysteine%2Fcystine+redox+state+in+bleomycin-induced+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).</li>
<li>Li, T., Folkesson, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+alpha-ENaC+inhibits+rat+lung+fluid+absorption+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).</li>
<li>Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+disperse+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+investigation+of+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicol%22%5BJournal%5D)">An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity.</a> Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).</li>
<li>Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+senescence-accelerated+mouse+model+in+bleomycin-induced+lung+injury+suggests+that+bone+marrow-derived+cells+can+alter+the+outcome+of+lung+injury+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).</li>
<li>Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intratracheal+instillation+of+budesonide+using+surfactant+as+a+vehicle+to+prevent+chronic+lung+disease+in+preterm+infants%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study.</a> Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).</li>
</ol>

在多项研究中，气管内灌注已被用于评估受试化合物的毒性（6），诱导肺泡损伤（4；7），替代表面活性物质（8），以及通过将小寡核苷酸直接递送至肺部来改变基因表达（5）。目前，我们正在探索将1）荧光氧化还原敏感材料灌注至肺内，以在正常和病理生理条件下体内测量氧化应激；以及2）将荧光指示剂与药理学化合物、DNA载体、病毒和/或microRNA共同灌注，以评估每种灌注物对肺液体转运的影响。
与吸入暴露相比，使用滴注法将外源物质引入肺部具有多种优势（详见文献(1)综述）。采用滴注法的主要优点在于能够限制对有毒、致癌或放射性化合物的暴露。此外，固体和液体物质均可通过该方法导入肺部。可以认为，气管滴注法最大的缺点是滴注过程具有侵入性且不符合生理状态。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Webster Veterinary</td><td>14043-220-05</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Lloyd, Inc.</td><td></td><td>New Animal Drug Application #139-236</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-001-10</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td></td><td></td><td>可在药店购买</td></tr><tr><td>1 mL 皮下注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td>26 5/8 G</td></tr><tr><td>4-0 尼龙缝线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>1894G.S30</td><td></td></tr></tbody></table>

直接向小鼠肺部气管内灌注溶质

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

气管内滴注可将溶质直接递送至肺部。该操作旨在将滴注液输送至肺的远端区域，因此常被用于肺泡相关研究。本文提供了一种在小鼠中进行气管内滴注的详细存活手术方案。利用该方法，可将待测溶质或固体物质（如肺部治疗药物、表面活性剂、病毒及小段寡核苷酸）靶向递送至肺远端。相较于主要作用于上呼吸道且可能使研究人员暴露于潜在有害物质的吸入法，气管滴注可能是更优的方法。此外，采用气管滴注方案，动物可在非侵入性操作后完全恢复，从而允许对同一实验动物进行后续生理学指标检测或重复给药。注入肺部的滴注液体积必须精确确定，并保持渗透压平衡，以确保动物顺利恢复。通常，可向小鼠肺部注入30–75 μL的滴注液。

经气管灌注可将溶质直接递送至肺部。该操作旨在将灌注液输送至肺的远端区域，因此常被用于肺泡相关研究。我们提供了一套详细的小鼠经气管灌注存活实验操作方案。

经气管灌注可将溶质直接递送至肺部。该操作旨在将灌注液输送至肺的远端区域。

在此操作中，可将溶质直接递送至肺部。首先进行气管插管。去除小型啮齿动物的毛发，并在其颈部前侧附近做一个小切口。暴露气管。使用1毫升皮下注射针，通过气管以每克体重3微升的剂量注入溶液。移除注射器后缝合伤口。大家好，我是来自埃默里大学生理学系的马赫尔姆斯博士。大家好，我是来自埃默里大学医学院的毛里西奥·罗哈斯博士。今天我们将向您展示一种将溶质直接灌注到肺远端区域的操作方法。在我的实验室中，我们常规使用该方法研究多种不同化合物灌注后对肺液体清除的影响，并利用该技术在小鼠体内构建肺损伤模型。将溶质直接注入小型啮齿类动物肺部可能对您的研究具有帮助。现在开始操作。手术前，先用异氟烷对小鼠进行初始麻醉，然后通过腹腔注射赛拉嗪和氯胺酮混合物以进一步镇静。通过脚趾夹捏测试确认动物已完全麻醉。然后使用电动剃须刀剃除手术区域的毛发。为清除残留的毛发，需在手术区域涂抹一层厚厚的脱毛膏，保持三分钟后，用湿润的毛巾擦去毛发和脱毛膏。用70%酒精擦拭手术区域，随后使用碘伏外科洗手液进行消毒，以无菌方式准备动物。此时动物已准备好进行手术。开始进行气管内给药操作时，将麻醉后的动物置于倾斜的手术板上。在颈部或喉部前方区域做一个小切口。使用镊子向后推开颈阔肌，然后在气管前侧肌肉上做一切口。这将使您能够观察并接触到气管环。暴露气管后，使用1毫升皮下注射针头和注射器注入适量的灌注液。持注射器时针尖斜面朝上，并与气管平行，将全部灌注液体积注入气管内。典型的气管内注射剂量为每克体重3 µL。将注射器从气管中取出。在溶液注入肺部后，动物可能会出现喘息反应。通过注射器通入空气并观察肺部是否扩张，也可确认气管插管成功。使用4-0尼龙缝线关闭切口。用持针器夹住针柄——即缝线所连接的针体最厚部分，将针尖以90度角刺入皮肤，进针位置距离伤口边缘约1至3毫米。根据皮肤厚度，在针头穿过组织一次后抓住穿出的针头。单独打结的简单缝合即可有效闭合此处所示的伤口。以下是一些气管内注射的代表性结果。第一张图像显示了荧光化合物Sci-Fi 0.5与葡聚糖结合后成功注射到C57BL/6小鼠肺部的结果。SCI 5.5 信号与X射线图像的共定位表明，荧光染料主要靶向肺部，并在给药后立即均匀分布。相比之下，第二幅图像显示了一只灌注不良小鼠的结果。操作后立即在胃肠道中观察到荧光信号，表明在操作过程中意外地将导管插入了食管。我们刚刚向您展示了如何将溶质直接灌注到肺部远端区域。在进行此项或其他任何操作时，必须遵守您所在机构关于实验动物使用的相关指南。就这些。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

溶质直接气管滴入小鼠肺

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小鼠非手术气管内灌注及通过流式细胞术分析肺组织和肺引流淋巴结

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肺部灌注与固定：通过气管引入液体并固定肺组织以测量固定肺容积

来源： Venuprasad, K., 等气管内给药 流感嗜血杆菌 在小鼠模型中研究气道炎症。 视频实验杂志...

在小鼠模型中进行气管内细菌递送

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使用模拟人类肺部疾病状况的模型对于研究特定疾病的病理生理学和/或病因学以及开发治疗干预措施至关重要。本文介绍了一种可将外源性物质直接递送至小鼠肺部的无创经气管插管方法。...

无创气管插管法研究小鼠肺部病理与生理

经插管介导的气管内（IMIT）试剂灌注是一种研究呼吸系统疾病以及将治疗性试剂直接递送至肺部的优良非侵入性方法。该方法快速且具有高度可重复性，适用于临床前测试。...

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本文的目的是介绍一些简单的方法，这些方法将极大地方便对患有肺癌或其他病理状况的小鼠肺组织进行制备和分析。我们提供了三种实验方案，用于简便且可靠地进行肺部灌注、固定以及肺容积测量。...

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