从白蚁肠道微生物（Zootermopsis Angusticollis）中提取的DNA和可视化肠道微生物

在这里，您对这种环境的反应并非独一无二。大多数人，甚至非科学家，都会感到非常震撼。是的，这源于其多样性和复杂性。

您好，我叫 Eric Matson，是加州理工学院环境与科学工程系的一名博士后。在我的导师 Jared Ledbetter 教授的指导下，我的研究主要关注栖息在白蚁后肠中的微生物相互作用及其物种多样性。特别是，我们对其中一些生化代谢途径感兴趣，尤其关注乙酸生成过程（ace agenesis），即这些微生物消耗氢气和 CO2 气体，并将其转化为乙酸盐，而乙酸盐是白蚁宿主能量代谢中的关键营养物质。

我和实验室的其他研究人员已开发出特异性引物组，用于检测该通路中的关键酶。但要实现这一目标，我们需要先获得纯净的微生物群落DNA样本，作为该过程的检测靶标。因此，今天我将演示如何解剖前述的白蚁物种，从中后肠提取DNA，并对其进行纯化，以供后续研究使用。

今天我们将重点关注一种白蚁，其学名为 Zoopsittermes nevadensis。这是一种在当地采集的加州湿木白蚁，体型相对较大，便于进行解剖和提取操作。好的，今天我已经准备好了实验所需的一些用品。

我们需要准备的第一件事是准备一定量的冰，用于冷却将要解剖的昆虫。我还预先冷却了一些TE缓冲液，其中含有一种化合物，有助于在此处细胞裂解释放出DNA后稳定其结构。我已准备好装有锆硅酸盐珠的无菌小管。

这些是直径0.1毫米的珠子，此处大约有半克左右。我们将实际进行机械剪切操作。此外，我还准备了几种用于裂解和纯化步骤的试剂。

这里我有一瓶含有1%聚乙烯聚一（PolyOne）或PVPP的缓冲液。PVPP对于去除DNA提取物中的腐殖酸非常重要，因为腐殖酸可能会抑制我们对结果的PCR分析。此外，我还准备了一些硫酸钠ECCO，这是一种表面活性剂，我们将用它来帮助提取并破坏细胞。

然后进行白蚁解剖时，我们只需要一些无菌镊子即可。这些镊子尖端较为精细，将用于实际取出白蚁的肠道。最后，为了进行机械剪切，我们使用一台蜜蜂研磨仪，该仪器以非常高的转速旋转，配合氧化锆硅酸盐珠，可实现对细胞的机械破碎。

在野外采集白蚁后，我们会将其带回实验室。我们研究的大多数加州湿木白蚁都非常容易失水干燥。因此，本实验室的一项技术改进是采用湿度可控的培养箱，例如这些10加仑的鱼缸。

在这里，我们收集单个菌落，并将它们分别保存在这些盒子中。在培养箱底部，放置着装有不同盐溶液的容器。这个特定的容器中含有磷酸钾溶液，可使相对湿度维持在95%至96%之间，这是最理想的条件。

在这些条件下，白蚁实际上已在人工饲养环境中成功繁殖；不过，当我们需要开展实验时，仍会从野外采集新鲜的样本。在这个盒子中，您可以看到它们取食的一些木材，这些只是我们在白蚁巢穴所在地采集的北美黄松或杰弗里松。

白蚁群体中有多种不同的品级，包括雄性和雌性繁殖个体。群体中大部分为工蚁，此外还有一定数量的兵蚁品级。有趣的是，兵蚁的口器为特化的上颚，其功能是保卫群体，而非取食木材。

因此，它们也依赖工蚁来喂养。因此，您可以在该容器中看到工蚁和兵蚁，以及一些刚从卵中孵化出来的幼体。在人工饲养环境下情况如此。

我已经从刚才展示的群体中选取了五只工蚁白蚁。首先，我将它们放在冰上进行冷藏处理。为了准备解剖，我将使用镊子，并在解剖显微镜的辅助下操作。希望你们能够清楚地看到，我们可以从每只个体中取出体积较大的肠道组织。

只需将白蚁翻转至背朝下，用一把镊子夹住头部，另一把镊子轻轻夹一下，位置就在腹部最末端此处。用一把镊子操作时，你应该能看到整个肠道从虫体中被取出。好了。

你可以看到其体积很大，约占昆虫体重的30%至40%，实际上就存在于该环境中。你可以观察到它被分为多个区段：我们有前肠、中肠，以及后肠的膨大部分——即一个非常大的腔室，其中含有执行发酵作用的大部分微生物群落。

在这里，我已取出五只工蚁的内脏。下一步是将其中所含的核酸在冰冻的 TE 缓冲液中进行稳定处理。如果在野外工作，此时可将其在 -20 °C 条件下冷冻保存。

或者我们可以直接继续进行提取步骤。但所有的细胞和DNA材料仍然存在于肠道内。我将把这些样本放入100 µL的TE缓冲液中。

好的，在正式开始提取肠道样本之前，我需要先配制将用于裂解细胞和组织的缓冲液。在这个已经装有约0.5克氧化锆珠的离心管中，我将加入700微升的PVPP，即含1% PVPP的TE缓冲液，以及50微升20%的SDS溶液。

在添加 PVPP 之前，必须将其重新悬浮，因为它不溶于水相缓冲液。此时，我们已准备好向样品中加入苯酚，因此我将使用移液器加入约 500 微升左右。好的。至此，我们即可开始提取步骤。是的。

加入苯酚后，我们即可加入先前从白蚁体内解剖获得的肠道样本，这有助于轻微研磨组织，使转移操作更方便。现在加入苯酚后，我们即可开始使用珠磨仪进行机械破碎。

我们将采用的方法是全速运行三个循环，每次30秒，中间间隔30秒冰浴。将样本置于冰上冷却非常关键，因为摩擦会导致样本温度升高。现在我将样本放入珠磨装置中，开始运行30秒。好的。

在操作结束时，您应观察到大部分组织已被充分匀浆。残留的团块应极少，并且您会发现溶液呈现出类似泡沫的外观，这可能是由于其中含有SDS所致。此时，我们即可进行离心，随后从此样品中开始实际的DNA提取与纯化过程。

现在我们已经通过机械方式破坏了细胞，接下来将离心去除不溶性物质。具体操作是将样品放入离心机，以8,000 ×g离心1分钟。此时，我们预期大部分可溶性物质将聚集在离心管底部附近。

我们感兴趣的是上层的水相溶液，这部分溶液将按照粗裂解液的操作步骤加入到 KaiGen DNA 提取试剂盒中。现在我们的样品已经完成离心，接下来将取 200 µL 上清液用于每次提取，仅使用 A-D-N-E-Z KaiGen 试剂盒，并按照试剂盒中针对粗裂解液所指定的方案提取 DNA。

现在我们已获得 200 微升的肠道样品，接下来我将使用 kyogen d easy 试剂盒，并按照针对粗裂解液的说明书进行操作。每次进行肠道提取时，检查肠道内容物的状态都是一个良好的实验习惯。为此，我们通过解剖一只白蚁，确认其内容物与以往观察到的具有一致性。

我们将通过观察这个微生物群落中的细胞来进行可视化分析，位置就在腹部的最末端。在一端，你应该能看到肠道结构。

这是一种缓冲盐溶液，其成分与白蚁肠道液体的实际组成非常接近。我只需将其稍微研磨一下，然后加入到显微镜载玻片上，我们就可以观察了。好的，现在我们已经准备好在显微镜下进行观察了。

是的，看起来效果很好。白蚁肠道。其中包含了生命三域中所有被认可的代表物种。

存在真核原生生物，存在古菌，也存在细菌。我们的实验室主要关注该环境中细菌种群。具体而言，在这种特定类型的白蚁中，SPI菌属（SPI kes）是群落中占主导地位的细菌成员之一。

而我们目前的研究表明，它们实际上在很大程度上参与了二氧化碳还原性乙酰酮生成。这些是多种不同类型的原生动物，被认为参与木质材料的初级降解过程。因此，人们认为它们含有木聚糖酶和纤维素酶，使其酶能够作用于这些木质多聚物。

然后，它们将这些物质发酵成单糖单体以及多聚物，而这些产物会进一步被群落中的其他成员分解。这些原生动物自身也会产生乙酸盐，但它们的一种副产物是氢气和CO2，而此处环境中的乙酸菌群则会利用或消耗这些氢气和CO2。在这里，你可以看到一群原生动物，可能就紧邻着一种非常大型的纤毛虫物种。

它是白蚁肠道中最大的生物体之一。当你继续向下观察，进入那些不含有这些大型原生动物细胞的区域时，会发现背景中的这种间质液同样充满了螺旋体和其他细菌细胞。因此，即使在这些区域，其复杂性也丝毫没有降低。

需要指出的一点是，后肠穿刺液的典型体积，例如我们在此观察的样本，根据白蚁的大小不同，通常在两到五微升之间。因此，我在此制作的湿片标本实际上至少是该环境的一比二十稀释。这意味着这些物种在真实的完整肠道中的密度远比此处所呈现的要高得多。

这能让您大致了解该环境中生命的密度以及多样性。今天我向您展示了如何从白蚁肠道中分离DNA，并获得这些纯化后的样品。接下来，我们将能够应用特异性的靶向引物组。

具体而言，我们将研究编码脱氢酶、一氧化碳脱氢酶以及四氢叶酸合成相关基因，这是我们实验室开发的三对引物组所针对的基因。我们旨在研究该环境中这些不同基因的多样性及其特定序列特征，因此需要对这些基因进行PCR扩增、克隆、测序，并构建基因文库。

根据这些结果，我们可以了解这些相互作用的某些特性，特别是通过这一过程，这些通路在不同微生物中是如何构建的。