Name: 从白蚁肠道微生物（Zootermopsis Angusticollis）中提取的DNA和可视化肠道微生物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 学习从白蚁（Zootermopsis angusticollis）后肠微生物中提取DNA并进行可视化分析的技术。该方法揭示肠道微生物群落的复杂多样性及其在能量代谢中的关键作用。

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白蚁完整肠道DNA提取的操作摘要：
<ol>
<li>将白蚁置于冰上冷却，用无菌镊子取出肠道，并将肠道样本置于缓冲液中稳定保存。</li>
<li>在含PVPP/SDS/苯酚的缓冲液中匀浆处理样本。</li>
<li>使用Qiagen DNeasy柱从粗裂解液中提取并纯化DNA。</li>
</ol>
实验方案：
<ol>
<li>在冰上使用无菌镊子从工蚁白蚁中取出肠道。</li>
<li>立即将肠道及其内容物转移至含有 50 μL 冰冷的 1x 分子生物学级 TE 缓冲液（1 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0）的无菌、无核酸酶试管中。&nbsp; 将样品在 -20°C 冻存，或直接进行匀浆处理。&nbsp; </li>
<li>将肠道样品和缓冲液转移至预先装有 500 mg 无菌氧化锆/二氧化硅珠（0.1 mm）和 700 μL 含 1% w/v 聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）的 1x TE 缓冲液的无菌、无核酸酶 2 ml 螺口管中。&nbsp; </li>
<li>向样品中加入 50 μL 20% 十二烷基硫酸钠（SDS）和 500 μL 苯酚。</li>
<li>使用最高档位进行匀浆（珠磨），共进行三个循环，每个循环包括 30 秒匀浆和 30 秒冰上冷却。</li>
<li>在 8,000x g 条件下离心 1 分钟，沉淀不溶性物质。</li>
<li>使用 Qiagen DNeasy 柱，按照粗裂解液纯化方法所述，对 300-μl 的水相（最上层）进行纯化。</li>
<li>定量核酸含量，并将样品在 -20°C 冻存以备后续使用。</li>
</ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

根据我们的经验，从类似内华达木白蚁（Zootermopis nevadensis）等食木白蚁物种的微生物群落中提取的DNA，经过一轮提取和纯化后，其纯度已足以作为PCR模板。然而，某些白蚁，如食腐屑或食土白蚁物种，其肠道内容物中腐殖酸浓度可能较高，可能需要对肠道微生物DNA进行额外的纯化步骤。5只Z. nevadensis工蚁肠道提取的总DNA产量约为10–30 μg。对于体型显著小于或大于该物种的白蚁，可能需要更多或更少的个体才能获得相当量的DNA。
该方法可轻松调整用于RNA提取。进行RNA提取时，用Qiagen的1× RNAprotect细菌试剂（目录号76506）替代方案第2步中所述的冰冻TE缓冲液。应使用Qiagen RNeasy试剂和柱子（目录号74104）替代上述DNeasy纯化步骤。由于DNA可从经RNAprotect稳定的样品中纯化，且核酸纯化仅需第7步中回收的约700 μL水相层中的300 μL，因此该方法可用于从单个样品中平行提取DNA和RNA。
这些技术依赖于从白蚁肠道环境中提取和纯化高质量的核酸。...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/苯酚</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>匀浆缓冲液</td></tr><tr><td>DNeasy 组织试剂盒</td><td>试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>按照基因组DNA从粗裂解液中提取的操作流程使用（附录H，产品说明书版本：2003年7月）</td></tr><tr><td>TE</td><td>缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1x 缓冲液（1 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0），由100x浓缩液稀释而成</td></tr><tr><td>氧化锆/二氧化硅珠</td><td>耗材</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0.1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>1% w/v 聚乙烯多吡咯烷酮，由干粉试剂配制，以TE缓冲液制成1x悬浮液</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>动物</td><td></td><td></td><td>白蚁</td></tr><tr><td>SDS</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>十二烷基硫酸钠，由干粉试剂配制成20%水溶液</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>经TE饱和，浓度约73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>工具</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>缓冲盐溶液，pH 7.2</td><td></td><td></td><td>每升配方：2.5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.6 g KCl，1.4 g NaCl，0.075 g CaCl，1 g MgCl，以及10 mL 1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;溶液</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>配备40x物镜、1.6x光学变倍器和10x目镜。样品采用相差照明观察</td></tr></tbody></table>

从木白蚁（zootermopsis angusticollis）肠道微生物中提取dna并观察肠道微生物

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

白蚁是已知少数能够仅以木材为食而生存的动物之一。白蚁肠道内含有密集且物种丰富的微生物群落，这些微生物主要将木质纤维素降解为乙酸，而乙酸是驱动白蚁新陈代谢的关键营养物质（Odelson & Breznak, 1983）。这些微生物群落包括细菌、产甲烷古菌，以及在某些“低等”白蚁中存在的真核原生生物。因此，白蚁是研究微生物物种之间相互作用及其为宿主执行多种生物化学功能的理想研究对象。研究人员已采用分子技术探索了白蚁肠道微生物群落的物种组成以及参与各种生物化学过程的关键基因（Kudo et al., 1998；Schmit-Wagner et al., 2003；Salmassi & Leadbetter, 2003）。这些技术依赖于从白蚁肠道环境中提取和纯化高质量的核酸。本视频所介绍的提取方法是对多种针对环境样品核酸提取与纯化方案（Mor et al., 1994；Berthelet et al., 1996；Purdy et al., 1996；Salmassi & Leadbetter, 2003；Ottesen et al., 2006）进行改良后整合而成，可从白蚁后肠材料中提取适用于聚合酶链式反应（PCR）模板的DNA。

本视频展示了从白蚁后肠中栖居的微生物物种提取DNA的技术。同时演示了湿封片的制备方法，该方法有助于观察肠道微生物群落，并带领观众了解这一物种丰富的肠道环境。

从木白蚁（Zootermopsis angusticollis）肠道微生物中提取DNA并观察肠道微生物

白蚁是已知少数能够仅以木材为食而生存的动物之一。白蚁肠道内含有密集且复杂的微生物群落，这些微生物在木质纤维的降解过程中发挥关键作用。

在这里，您对这种环境的反应并非独一无二。大多数人，甚至非科学家，都会对此感到十分震撼。是的，这源于其多样性和复杂性。您好，我叫 Eric Matson，是加州理工学院环境与科学工程系的一名博士后。在我的导师 Jared Ledbetter 教授的指导下，我的研究主要关注栖息在白蚁后肠中的微生物相互作用及其物种多样性。特别是，我们对其中一些生化途径感兴趣，尤其关注乙酸生成过程（ace agenesis），即这些微生物消耗氢气和 CO2 气体，并将其转化为乙酸，而乙酸是白蚁宿主能量代谢中的关键营养物质。我和实验室的其他研究人员已开发出特异性引物组，用于检测该通路中的关键酶。但要实现这一目标，我们需要先获得纯净的微生物群落DNA样本，作为该过程的检测靶标。因此，今天我将演示如何解剖前述的白蚁物种，从中后肠提取DNA，随后进行纯化，以供后续研究使用。今天我们将重点关注一种白蚁，其学名为 Zoopsittermes nevadensis。这是一种在当地采集的加州湿木白蚁，体型相对较大，便于进行解剖和提取操作。好的，今天我已经准备好了实验所需的一些用品。我们需要准备的第一件事是准备一定量的冰，用于冷却将要解剖的昆虫。我还预先冷却了一些TE缓冲液，其中含有一种化合物，有助于在此处细胞裂解释放DNA后稳定其结构。我已准备好装有锆硅酸盐珠的无菌小瓶。这些是直径0.1毫米的珠子，此处大约有半克左右。我们将实际进行机械剪切操作。此外，我还准备了若干用于裂解和纯化步骤的试剂。这里有一个瓶子，其中含有1%的聚乙烯聚一（PolyOne）或PVPP的缓冲液。PVPP对于去除DNA提取物中的腐殖酸非常重要，因为腐殖酸可能会抑制我们对结果的PCR分析。此外，我还准备了一些硫酸钠ECCO，这是一种表面活性剂，我们将用它来帮助提取并破坏细胞。然后进行白蚁解剖时，我们只需要一些无菌镊子。这些镊子尖端较细，正是我们用来取出肠道组织的工具。最后，为了进行机械剪切，我们这里有一个组织研磨仪，其旋转速度非常高，配合氧化锆硅酸盐珠子，可实现对细胞的机械破碎。在野外采集白蚁后，我们将它们带回实验室。我们研究的大多数加州湿木白蚁都非常容易失水干燥。因此，本实验室的一项改进措施是采用湿度可控的培养箱，例如这些10加仑的鱼缸。在这里，我们收集单个菌落，并将它们分别保存在这些盒子中。培养箱底部放置了装有不同盐溶液的容器。这个特定的容器中含有磷酸钾溶液，可使相对湿度维持在95%至96%左右，这是最适宜的条件。在这些条件下，白蚁实际上已在人工饲养环境中成功繁殖。不过，当我们需要开展实验时，仍会从野外采集新鲜样本。在这个盒子中，您可以看到一些它们取食的木材。这些只是我们在白蚁巢穴所在地采集的北美黄松或杰弗里松。白蚁群体中有多种不同的品级，包括雄性和雌性繁殖个体。群体中的大多数成员是工蚁，此外还有一定数量的兵蚁品级。有趣的是

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科研

JoVE Journal

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生物学

从白蚁肠道微生物（Zootermopsis Angusticollis）中提取的DNA和可视化肠道微生物

探究白蚁后肠中的微生物群落——访谈

Jared Leadbetter 带我们进行了一次自然观察之旅，探索白蚁后肠中栖息的生命多样性——这个微环境包含了地球上其他任何地方都找不到的 250 种不同物种。Jared...

共生的层次——可视化白蚁后肠微生物群落

我们介绍了利用荧光显微镜证明配体结合于台湾乳白蚁肠道内纤维素消化原生动物表面膜的方法，并展示了将配体与裂解肽偶联可杀死这些原生动物的实验流程。 体外 （厌氧原生动物培养）和 体内...

测试配体裂解肽对白蚁肠道原生动物的杀原虫活性 体外 （原生动物培养）和 体内 （白蚁后肠的显微注射）

通过稳定同位素示踪（SIP）结合焦磷酸测序技术，确定了与埃及棉铃虫（Spodoptera...

通过使用 13C-葡萄糖的DNA稳定同位素示踪法鉴定广食性昆虫Spodoptera littoralis肠道中具有代谢活性的细菌

本文介绍了一种获取土壤、根际和根内微生物组扩增子序列数据的实验方案。该信息可用于研究与植物相关的微生物群落的组成和多样性，适用于多种植物物种。...

探索根系微生物组：从土壤、根际和根内圈提取细菌群落数据

本文介绍了一种利用改良的整体原位杂交方法，对蜱肠道内可存活微生物群在空间和时间上的分布进行评估的实验方案。...

通过整体染色法观察蜱肠道微生物群 原位 杂交

这一简化的实验方案详细描述了从组织固定到利用荧光标记微生物，以检测和成像复杂组织样本中细菌的工作流程 原位 杂交...

通过荧光技术可视化肠道微生物群-宿主相互作用 原位 杂交、凝集素染色与成像

野生的Caenorhabditis线虫与多种微生物相关，这些微生物通常位于肠道腔内或感染肠道。本方案详细介绍了一种利用dauer幼虫角质层的抗性来富集定植于肠道中不可培养微生物的方法。...

选择性清洗野生 Caenorhabditis 线虫以富集肠道微生物组细菌

为了获得无菌昆虫，需对其卵表面进行消毒，孵化后的幼虫随后使用无菌叶片进行饲养。该方法为无菌昆虫的制备提供了一种高效途径，无需使用抗生素或开发人工饲料，也可应用于其他食叶昆虫。...

利用组织培养幼苗制备和饲养无菌昆虫以研究叶甲虫宿主-肠道微生物互作

堆肥微宇宙实验将自然界中存在的微生物多样性引入实验室，以促进对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

堆肥微宇宙作为微生物组研究中微生物多样性高且接近自然环境的实验体系 秀丽隐杆线虫

我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。...

切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

学习从白蚁（Zootermopsis angusticollis）后肠微生物中提取DNA并进行可视化分析的技术。该方法揭示肠道微生物群落的复杂多样性及其在能量代谢中的关键作用。

从木白蚁（Zootermopsis angusticollis）肠道微生物中提取DNA并观察肠道微生物

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