Name: 从白蚁肠道微生物（Zootermopsis Angusticollis）中提取的DNA和可视化肠道微生物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 学习从白蚁（Zootermopsis angusticollis）后肠微生物中提取DNA并进行可视化分析的技术。该方法揭示肠道微生物群落的复杂多样性及其在能量代谢中的关键作用。

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白蚁完整肠道DNA提取的操作摘要：
<ol>
<li>将白蚁置于冰上冷却，用无菌镊子取出肠道，并将肠道样本置于缓冲液中稳定保存。</li>
<li>在含PVPP/SDS/苯酚的缓冲液中匀浆处理样本。</li>
<li>使用Qiagen DNeasy柱从粗裂解液中提取并纯化DNA。</li>
</ol>
实验方案：
<ol>
<li>在冰上使用无菌镊子从工蚁白蚁中取出肠道。</li>
<li>立即将肠道及其内容物转移至含有 50 μL 冰冷的 1x 分子生物学级 TE 缓冲液（1 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0）的无菌、无核酸酶试管中。&nbsp; 将样品在 -20°C 冻存，或直接进行匀浆处理。&nbsp; </li>
<li>将肠道样品和缓冲液转移至预先装有 500 mg 无菌氧化锆/二氧化硅珠（0.1 mm）和 700 μL 含 1% w/v 聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）的 1x TE 缓冲液的无菌、无核酸酶 2 ml 螺口管中。&nbsp; </li>
<li>向样品中加入 50 μL 20% 十二烷基硫酸钠（SDS）和 500 μL 苯酚。</li>
<li>使用最高档位进行匀浆（珠磨），共进行三个循环，每个循环包括 30 秒匀浆和 30 秒冰上冷却。</li>
<li>在 8,000x g 条件下离心 1 分钟，沉淀不溶性物质。</li>
<li>使用 Qiagen DNeasy 柱，按照粗裂解液纯化方法所述，对 300-μl 的水相（最上层）进行纯化。</li>
<li>定量核酸含量，并将样品在 -20°C 冻存以备后续使用。</li>
</ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

根据我们的经验，从类似内华达木白蚁（Zootermopis nevadensis）等食木白蚁物种的微生物群落中提取的DNA，经过一轮提取和纯化后，其纯度已足以作为PCR模板。然而，某些白蚁，如食腐屑或食土白蚁物种，其肠道内容物中腐殖酸浓度可能较高，可能需要对肠道微生物DNA进行额外的纯化步骤。5只Z. nevadensis工蚁肠道提取的总DNA产量约为10–30 μg。对于体型显著小于或大于该物种的白蚁，可能需要更多或更少的个体才能获得相当量的DNA。
该方法可轻松调整用于RNA提取。进行RNA提取时，用Qiagen的1× RNAprotect细菌试剂（目录号76506）替代方案第2步中所述的冰冻TE缓冲液。应使用Qiagen RNeasy试剂和柱子（目录号74104）替代上述DNeasy纯化步骤。由于DNA可从经RNAprotect稳定的样品中纯化，且核酸纯化仅需第7步中回收的约700 μL水相层中的300 μL，因此该方法可用于从单个样品中平行提取DNA和RNA。
这些技术依赖于从白蚁肠道环境中提取和纯化高质量的核酸。...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/苯酚</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>匀浆缓冲液</td></tr><tr><td>DNeasy 组织试剂盒</td><td>试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>按照基因组DNA从粗裂解液中提取的操作流程使用（附录H，产品说明书版本：2003年7月）</td></tr><tr><td>TE</td><td>缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1x 缓冲液（1 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0），由100x浓缩液稀释而成</td></tr><tr><td>氧化锆/二氧化硅珠</td><td>耗材</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0.1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>1% w/v 聚乙烯多吡咯烷酮，由干粉试剂配制，以TE缓冲液制成1x悬浮液</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>动物</td><td></td><td></td><td>白蚁</td></tr><tr><td>SDS</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>十二烷基硫酸钠，由干粉试剂配制成20%水溶液</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>经TE饱和，浓度约73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>工具</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>缓冲盐溶液，pH 7.2</td><td></td><td></td><td>每升配方：2.5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.6 g KCl，1.4 g NaCl，0.075 g CaCl，1 g MgCl，以及10 mL 1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;溶液</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>配备40x物镜、1.6x光学变倍器和10x目镜。样品采用相差照明观察</td></tr></tbody></table>

从木白蚁（zootermopsis angusticollis）肠道微生物中提取dna并观察肠道微生物

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

白蚁是已知少数能够仅以木材为食而生存的动物之一。白蚁肠道内含有密集且物种丰富的微生物群落，这些微生物主要将木质纤维素降解为乙酸，而乙酸是驱动白蚁新陈代谢的关键营养物质（Odelson & Breznak, 1983）。这些微生物群落包括细菌、产甲烷古菌，以及在某些“低等”白蚁中存在的真核原生生物。因此，白蚁是研究微生物物种之间相互作用及其为宿主执行多种生物化学功能的理想研究对象。研究人员已采用分子技术探索了白蚁肠道微生物群落的物种组成以及参与各种生物化学过程的关键基因（Kudo et al., 1998；Schmit-Wagner et al., 2003；Salmassi & Leadbetter, 2003）。这些技术依赖于从白蚁肠道环境中提取和纯化高质量的核酸。本视频所介绍的提取方法是对多种针对环境样品核酸提取与纯化方案（Mor et al., 1994；Berthelet et al., 1996；Purdy et al., 1996；Salmassi & Leadbetter, 2003；Ottesen et al., 2006）进行改良后整合而成，可从白蚁后肠材料中提取适用于聚合酶链式反应（PCR）模板的DNA。

本视频展示了从白蚁后肠中栖居的微生物物种提取DNA的技术。同时演示了湿封片的制备方法，该方法有助于观察肠道微生物群落，并带领观众了解这一物种丰富的肠道环境。

从木白蚁（Zootermopsis angusticollis）肠道微生物中提取DNA并观察肠道微生物

白蚁是已知少数能够仅以木材为食而生存的动物之一。白蚁肠道内含有密集且复杂的微生物群落，这些微生物在木质纤维的降解过程中发挥关键作用。

在这里，您对这种环境的反应并非独一无二。大多数人，甚至非科学家，都会对此感到十分震撼。是的，这源于其多样性和复杂性。您好，我叫 Eric Matson，是加州理工学院环境与科学工程系的一名博士后。在我的导师 Jared Ledbetter 教授的指导下，我的研究主要关注栖息在白蚁后肠中的微生物相互作用及其物种多样性。特别是，我们对其中一些生化途径感兴趣，尤其关注乙酸生成过程（ace agenesis），即这些微生物消耗氢气和 CO2 气体，并将其转化为乙酸，而乙酸是白蚁宿主能量代谢中的关键营养物质。我和实验室的其他研究人员已开发出特异性引物组，用于检测该通路中的关键酶。但要实现这一目标，我们需要先获得纯净的微生物群落DNA样本，作为该过程的检测靶标。因此，今天我将演示如何解剖前述的白蚁物种，从中后肠提取DNA，随后进行纯化，以供后续研究使用。今天我们将重点关注一种白蚁，其学名为 Zoopsittermes nevadensis。这是一种在当地采集的加州湿木白蚁，体型相对较大，便于进行解剖和提取操作。好的，今天我已经准备好了实验所需的一些用品。我们需要准备的第一件事是准备一定量的冰，用于冷却将要解剖的昆虫。我还预先冷却了一些TE缓冲液，其中含有一种化合物，有助于在此处细胞裂解释放DNA后稳定其结构。我已准备好装有锆硅酸盐珠的无菌小瓶。这些是直径0.1毫米的珠子，此处大约有半克左右。我们将实际进行机械剪切操作。此外，我还准备了若干用于裂解和纯化步骤的试剂。这里有一个瓶子，其中含有1%的聚乙烯聚一（PolyOne）或PVPP的缓冲液。PVPP对于去除DNA提取物中的腐殖酸非常重要，因为腐殖酸可能会抑制我们对结果的PCR分析。此外，我还准备了一些硫酸钠ECCO，这是一种表面活性剂，我们将用它来帮助提取并破坏细胞。然后进行白蚁解剖时，我们只需要一些无菌镊子。这些镊子尖端较细，正是我们用来取出肠道组织的工具。最后，为了进行机械剪切，我们这里有一个组织研磨仪，其旋转速度非常高，配合氧化锆硅酸盐珠子，可实现对细胞的机械破碎。在野外采集白蚁后，我们将它们带回实验室。我们研究的大多数加州湿木白蚁都非常容易失水干燥。因此，本实验室的一项改进措施是采用湿度可控的培养箱，例如这些10加仑的鱼缸。在这里，我们收集单个菌落，并将它们分别保存在这些盒子中。培养箱底部放置了装有不同盐溶液的容器。这个特定的容器中含有磷酸钾溶液，可使相对湿度维持在95%至96%左右，这是最适宜的条件。在这些条件下，白蚁实际上已在人工饲养环境中成功繁殖。不过，当我们需要开展实验时，仍会从野外采集新鲜样本。在这个盒子中，您可以看到一些它们取食的木材。这些只是我们在白蚁巢穴所在地采集的北美黄松或杰弗里松。白蚁群体中有多种不同的品级，包括雄性和雌性繁殖个体。群体中的大多数成员是工蚁，此外还有一定数量的兵蚁品级。有趣的是，兵蚁的口器特化为用于保卫群体的上颚，而不是用于取食木材。因此，它们也依赖工蚁来喂养。因此，您可以在该箱中看到工蚁和兵蚁，以及一些刚从卵中孵化出来的幼体。在人工饲养环境下情况如此。我从刚才展示的群体中选取了五只工蚁。首先，我已将它们放在冰上进行冷藏处理。为了准备解剖，我将使用这些镊子，并在解剖显微镜下操作。希望你们能够清楚地看到，我们可以从每只个体中取出体积较大的肠道组织。只需将白蚁翻转至背朝下，用一把镊子夹住头部，另一把镊子轻轻夹一下，位置就在腹部最末端此处。用一把镊子轻轻一拉，即可看到整个肠道从虫体中被取出。好的。你可以看到其体积很大，昆虫体重的大约30%至40%实际上存在于这一环境中。并且你可以观察到它被分为多个区段：我们有前肠、中肠，以及后肠的膨大部分——这是一个非常大的腔室，其中含有大部分负责发酵作用的微生物群落。现在我已经取出了五只工蚁的内脏。下一步是将其中所含的核酸在冰冻的TE缓冲液中进行稳定处理。如果在野外工作，此时可将样本在-20 °C条件下冷冻保存。或者我们可以直接继续进行提取步骤。但所有的细胞和DNA材料仍然存在于肠道内。我将把这些样本放入100 µL的TE缓冲液中。好的，在正式开始提取肠道样本之前，我需要先配制用于裂解细胞和组织的缓冲液。在这个已经装有约0.5克氧化锆珠的离心管中，我将加入700微升的PVPP，即1%的TE缓冲液，以及50微升20%的SDS溶液。在添加 PVPP 之前，必须重新悬浮，因为它不溶于水性缓冲液。此时，我们已准备好将苯酚加入样品中，因此我将使用移液器加入约 500 微升左右的苯酚。好的。至此，我们已准备好开始提取。是的。加入苯酚后，我们即可加入之前从白蚁体内解剖获得的肠道样品，稍加研磨组织有助于样品的分散，使转移操作更为容易。现在加入苯酚后，我们即可开始使用珠磨装置进行机械破碎。我们将采用的方法是全速运行三个循环，每次30秒，中间间隔30秒冰浴。将样品置于冰上这一步骤至关重要，因为由于摩擦作用，样品容易升温，因此需要通过冰浴降温。现在我将样品放入珠磨装置中，运行30秒。好的。在该步骤结束时，你应该观察到大部分组织已被充分匀浆。残留的团块应非常少，并且你会看到溶液呈现出类似泡沫的外观，这可能是由于其中含有SDS所致。此时，我们已准备好进行离心，随后即可从该样品中开始实际的DNA提取与纯化过程。现在我们已经通过机械方式破坏了细胞，接下来将离心去除不溶性物质。具体操作是将样品放入离心机，以8,000 ×g 的离心力离心1分钟。此时我们预期大部分可溶性物质会聚集在离心管底部附近。我们感兴趣的是上层的水相溶液。这部分溶液将按照粗裂解液的操作步骤，直接加入到KaiGen DNA提取试剂盒中。现在我们的样品已经完成离心，接下来将取200 µL上清液用于每次提取，仅使用A-D-N-E-Z KaiGen试剂盒，并按照试剂盒推荐的粗裂解液提取方案进行DNA提取。现在我们已获得 200 微升的肠道样品，接下来我将使用 kyogen d easy 试剂盒，并按照粗裂解液的实验方案进行操作。每次进行肠道提取时，检查肠道内容物的状态都是一个良好的实验习惯。为此，我们通过解剖一只白蚁，确认其内容物与以往观察到的典型特征一致。我们将通过观察该微生物群落中的细胞，在视觉上实现这一点。位置就在腹部的最末端此处。借助一极，你应该能看到肠道结构。这是一种缓冲盐溶液，其成分与白蚁肠道液的实际组成非常接近。我只需将其稍微研磨一下，然后加入到显微镜载玻片上，我们就可以观察了。好的，现在我们已经准备好在显微镜下进行观察了。是的，看起来效果很好。白蚁肠道中包含了生命三域的所有代表性生物。存在真核原生生物，存在古菌，也存在细菌。我们的实验室主要关注该环境中细菌种群。具体而言，在这种特定类型的白蚁中，SPI菌属（SPI kes）是群落中占主导地位的细菌成员之一。而我们目前的研究表明，这些生物实际上在很大程度上参与了二氧化碳还原性酮生成过程。因此，这些只是多种不同类型的原生动物，据认为它们参与了木材的初级降解过程。因此，人们认为它们含有木聚糖酶和纤维素酶，使其酶能够作用于这些木质聚合物。然后，它们将这些物质发酵成单糖单体以及多聚物，而这些产物会进一步被群落中的其他成员分解。这些原生动物自身也会产生乙酸盐，但它们的一种副产物是氢气和CO2，而此处环境中的乙酸菌种群则会利用或消耗这些氢气和CO2。在这里，你可以看到一群原生动物，可能就聚集在一种非常大型的纤毛虫及其周围。它是白蚁肠道中最大的生物体之一。当你继续向下观察，看到那些不含这些大型原生动物细胞的区域时，会发现背景中的间质液也充满了螺旋体和其他细菌细胞。因此，即使在这些区域，其复杂性也丝毫未减。需要指出的一点是，后肠穿刺液的典型体积（例如我们在此观察的样本）根据白蚁的大小，通常在两到五微升之间。因此，我在此制作的湿片标本实际上至少代表了该环境的一比二十稀释。也就是说，这些物种在真实的完整肠道中的密度远比此处所呈现的要高得多。这能让您大致了解该环境中生命的密度以及多样性。今天我向您展示了如何从白蚁肠道中分离DNA，并获得这些纯化样品。接下来，我们将能够应用特异性的靶向引物组。具体而言，我们将研究编码脱氢酶、一氧化碳脱氢酶以及甲酰四氢叶酸合成相关基因，这是我们实验室开发的三对引物组。我们旨在研究该环境中这些不同基因的多样性和特定序列特征，因此需要对这些基因进行PCR扩增、克隆、测序，并构建基因文库。根据这些结果，我们可以了解这些相互作用的某些特性，特别是通过这一过程，这些通路在不同微生物中是如何构建的。

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生物学

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