Name: 花香浸改造拟南芥检查 pTSO2:β-葡萄糖醛酸酶报告基因的表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习利用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，并通过GUS报告基因检测转基因幼苗中的基因表达。该方法为植物基因功能研究提供了可靠的技术手段。

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感谢 Chunxin Wang 构建 pTSO2::GUS 载体并提供图1中的照片，感谢 Detlef Weigel 分享 GUS-foolproof 实验方案，感谢 Paja Sijacic 和 Courtney Hollender 提出的有益建议。Z. L. 实验室的研究工作由美国国家科学基金会（IOB0616096 和 MCB0744752）资助。Z.L. 还部分得到了马里兰大学农业实验站的支持。

I. 花浸法转化 拟南芥
<ol>
	<li>转化前约1个月，播种 拟南芥 将种子播种到4至8个花盆（5英寸方形盆）中，每盆约10-15株植物。对于育性正常的植物，每种质粒构建体种植4盆即可。若需转化突变体 拟南芥 生育力降低时，应相应增加花盆数量。</li>
	<li>植物在标准条件下培养（16小时光照，8小时黑暗） 22°C）。如果植物在较短日照或较低温度条件下生长，开花时间会延长，达到适合转化的状态所需时间也会更长。良好的植株管理可确保植株健康，而健康的植株是成功转化的关键。</li>
	<li>当植株刚刚抽薹并开始开花时，即可进行转化。为了提高转化效率，在转化前3-4天，一旦主花序抽薹，立即剪除，以促进更多侧枝的形成。转化前一天给植株浇水，以确保土壤在花序浸润过程中不会吸收过多的侵染液。</li>
	<li>转化前两天，在含有适当抗生素的40 ml LB培养基中接种（若使用 pTSO2::GUS, 50 μg/ml 卡那霉素）与 农杆菌 根癌农杆菌 携带GV3101菌株的 pTSO2::GUS 构建。该 pTSO2::GUS 克隆于 pBIN20 具有以下特性的载体 NPTII 赋予卡那霉素抗性的基因3. 在28-30°C.</li>
	<li>次日，将8ml过夜培养物转移至含LB培养基的400ml中 50 μg/ml 卡那霉素。在28-30°C.</li>
	<li>转化当天，当OD600 的 农杆菌 培养物浓度达到约 0.8（OD600 介于0.5至1之间为可接受范围），离心沉淀 农杆菌 5000 rpm 离心 8 分钟。</li>
	<li>重悬 农杆菌 在1 L（升）侵染培养基（10 mM MgCl₂）中重悬菌体沉淀2，5% 蔗糖，0.44 mM 6-苄基腺嘌呤（BA），0.3% Silwet L-77，1× Gamborg's 维生素溶液和灭菌水）。该培养基无需高压灭菌，但需新鲜配制。将 1 L 农杆菌含渗透介质的培养皿（如 8"x15"x2" Pyrex 玻璃皿）</li>
	<li>将花盆倒置（植株不会脱落），依次将每盆植物的地上部分浸入浸润溶液中，保持5分钟。在植物地上部分完全浸入浸润液期间，避免土壤吸收任何浸润液，以减少土壤表面真菌生长的可能性。</li>
	<li>浸润后，将所有浸润过的盆钵侧放在托盘中多层纸巾上。纸巾可吸收多余的浸润培养基。用塑料膜覆盖托盘以保持高湿度。将托盘放入植物生长室中。</li>
	<li>次日，取下塑料膜和纸巾，将花盆直立放置。此后四至五天内不要浇水。之后正常养护植株，直至结籽，并批量收集种子。</li>
	<li>将含有MS培养基的培养皿（150×15 mm培养皿）倒入 50 μg/ml 卡那霉素（称取2.2 g不含维生素的MS基础盐，溶于500 ml水中，用1 M NaOH调节pH至5.8，加入4 g琼脂，高压灭菌，冷却后加入卡那霉素） 50 μg/ml 终浓度）。将培养板置于 4°C 直至需要时</li>
	<li>为筛选具有抗生素抗性的转基因植株，至少需要筛选20,000粒种子。0.1克约等于5,000粒种子。称重并估算种子数量。</li>
	<li>将种子置于15 ml Falcon管中，用70%乙醇振荡处理30秒以灭菌。用无菌水洗涤种子一次。将种子浸入含市售5%次氯酸钠（Clorox）按1:10稀释的溶液中30秒。用无菌水冲洗种子三至六次。在超净工作台中，用移液器将约5000粒种子转移至每块MS（卡那霉素）培养基平板上，均匀铺开种子，用3M Micropore胶带密封平板以防止污染。</li>
	<li>将培养板置于培养箱中孵育 4°C 在黑暗条件下培养 3-4 天，然后将培养板转移至培养室（可使用相同的植物生长培养室）。约 14 天后，转基因幼苗保持绿色，而非转基因幼苗则逐渐变黄并死亡。将转基因幼苗从培养基中缓慢拔出根部，移栽至土壤中。</li>
</ol>
II. 检测 pTSO2::GUS 表达模式
<ol>
	<li>收获 pTSO2::GUS 转基因幼苗，并将其放入盛有预冷90%丙酮的玻璃闪烁瓶或微量离心管中，置于冰上。若需分析大量样品，也可使用聚苯乙烯微孔板（不可使用聚丙烯材质）。</li>
	<li>待所有样品收获完毕后，将样品管于室温放置20分钟。在此期间，配制不含x-Gluc的新鲜染色缓冲液（0.2% Triton x-100，50 mM NaHPO4 缓冲液 pH 7.2，2 mM 亚铁氰化钾，2 mM 铁氰化钾），并置于冰上备用。</li>
	<li>去除样品中的丙酮，加入染色缓冲液。</li>
	<li>配制x-Gluc染色液（0.2% Triton x-100，50 mM NaHPO4 缓冲液 pH 7.2，2 mM 亚铁氰化钾，2 mM 铁氰化钾，2 mM x-Gluc）。去除样品中的染色缓冲液，加入含x-Gluc的染色液。</li>
	<li>将样品置于真空条件下浸润15至20分钟。缓慢释放真空，确认所有样品沉入染色液液面以下。如有必要，重复浸润操作，直至释放真空后所有样品均下沉。</li>
	<li>将样品在含x-Gluc的染色液中于37°C过夜孵育。</li>
	<li>从孵育器中取出样品，去除染色液。依次用20%、35%和50%乙醇溶液在室温下洗涤，每次更换溶液后洗涤30分钟。</li>
	<li>用FAA固定液（50%乙醇、5%甲醛、10%乙酸，其余为水）在室温下固定组织30分钟。去除FAA，加入70%乙醇。此时可在配备数码相机的解剖显微镜下观察并拍照记录组织。深蓝色区域表示 TSO2 的表达位置（图1）。或者，组织可在4°C下保存，以备后续观察。 
	 
	<img alt="植物组织化学染色；植物组织中β-葡萄糖醛酸酶活性的显微图像。" src="/files/ftp_upload/1952/1952fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
	图1. pTSO2::GUS 在转基因幼苗（A）、侧根（B）和根尖（C）中的表达。注意 TSO2 启动子在幼嫩且正在分裂的组织中具有高度活性。（C）中所示的散在表达模式是特定细胞周期阶段表达基因的典型特征。</li>
</ol>
代表性结果
操作正确时，转化效率应约为 0.1–0.2%。换句话说，每筛选 5000 粒种子应获得 5–10 株转基因幼苗。平均而言，通过转化 4 盆野生型植株可获得约 100 株转基因株系。
对于含有pTSO2::GUS构建体的转基因幼苗3，反映GUS活性的深蓝色出现在活跃分裂的细胞中，包括幼叶、茎尖、根尖和侧根原基（图1）。这种不均匀的散在分布模式是细胞周期时相特异性表达的特征。

<ol><li>Clough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+agrobacterium-mediated+germ+line+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation.</a> Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).</li>
<li>Wang, C., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ribonucleotide+reductases+are+critical+for+cell+cycle+progression%2C+DNA+damage+repair%2C+and+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development.</a> Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

转化效率由多种不同因素决定，这些因素将在下文讨论：
<ol>
<li> 植物的健康状况及其苗龄至关重要。理想材料为约一个月大、带有大量未成熟花蕾的植株。在转化前3-4天剪除主茎以促进侧枝生成，可提高转化效率。较老的植株虽也能获得转化子，但效率较低。</li>
<li> 植物的育性非常重要。若需转化育性降低的突变体，则需要准备更多的植株用于浸染。</li>
<li> 浸染缓冲液中添加0.3% Silwet L-77表面活性剂被认为是必需的。</li>
<li> 植株在浸染液中的浸染时间应至少持续5分钟。</li>
<li> 为减少真菌污染，需采取多项预防措施。首先，应在浸染前一天对植株或土壤浇水，避免土壤在浸染过程中吸收浸染液；切勿将土壤浸入浸染液中。其次，浸染后24小时内应移除塑料覆盖物和纸巾，以降低湿度。第三，浸染后至少5天内不要浇水。</li>
</ol>
根据特定的质粒构建，转基因植物的筛选方法可能有所不同。如果质粒载体携带赋予对草铵膦铵盐抗性的 Bar（双丙氨膦乙酰转移酶）标记基因，则可直接将种子播种于土壤中，无需对种子进行任何灭菌处理。随后每隔几天用1:1000稀释的草铵...

<table><tbody><tr><td>6-苄基腺嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>852430</td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>Crompton Corp.</td><td></td><td>有毒，操作时佩戴手套</td></tr><tr><td>MS基础培养基（Murashige 和 Skoog 基本培养基）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg&amp;rsquo;s 维生素溶液 1000倍浓缩液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚基 &amp;#946;-D-葡糖苷酸环己胺盐）</td><td>Biosynth International, Inc</td><td>B-7300</td><td>有毒，避光保存，置于暗处</td></tr><tr><td>3M 微孔胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>19027761</td><td></td></tr></tbody></table>

花浸法转化 拟南芥 用于检查 ptso2::β-葡萄糖醛酸酶 报告基因表达

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

将外源基因导入生物体的能力是现代生物学和生物技术的基础。在模式开花植物中Arabidopsis thaliana，花序浸润转化法1-2因其简便、高效且成本低廉，已取代所有先前的方法。具体而言，幼嫩开花植株的茎尖Arabidopsis植物被浸入一种溶液中Agrobacterium tumefaciens携带特定质粒构建体。浸染后，将植株放回正常生长条件并收获种子，其中极小部分种子因转入了外源基因，可在含抗生素的培养基上被筛选出来。该花序浸染法极大地促进了Arabidopsis研究极大地促进了我们对植物基因功能的理解。在本研究中，我们采用花序浸润法（floral-dip method）转化一个报告基因，β-葡萄糖醛酸苷酶 (GUS)，在控制下TSO2启动子TSO2，编码核糖核苷酸还原酶（RNR）小亚基3, 是一种在细胞周期中受调控的基因，对细胞周期S期的脱氧核苷二磷酸（dNDP）生物合成至关重要。对该基因的检测GUS转基因中的表达Arabidopsis幼苗显示TSO2在活跃分裂的组织中表达。所报道的实验方法和材料不仅易于应用于科研，也可轻松适用于高中和大学阶段的教育。

本文介绍了花序浸渍法 Agrobacterium tumefaciens 介导的转化 拟南芥通过引入细胞周期调控的启动子-报告基因系统， pTSO2::β-葡萄糖醛酸酶（GUS），进入 拟南芥我们展示了如何在转基因幼苗中检测GUS报告基因的表达。

花浸法转化 拟南芥 用于检查 pTSO2::β-葡萄糖醛酸酶 报告基因表达

将外源基因导入生物体的能力是现代生物学与生物技术的基础。在模式开花植物拟南芥（Arabidopsis）中……

花序浸渍法用于将含有报告基因载体的农杆菌溶液浸染拟南芥植株。随后检测获得的转基因植株中报告基因的表达情况。首先将处于早期开花阶段的拟南芥植株浸入含有报告基因载体的农杆菌溶液中。接下来，将植株恢复至正常的生长条件，直至其产生种子，其中仅有少量种子会成功转入外源基因。该实验流程的第三步是收集植株上的种子，并将其播种于含有抗生素的筛选培养基上。最后，观察在含抗生素的筛选培养基上生长的幼苗。含有外源基因的转基因幼苗对抗生素具有抗性，能够存活下来，而非转基因幼苗最终会变白并死亡。通过用报告基因的底物对转基因幼苗进行染色，并在解剖显微镜下观察细胞和组织，可以检测转基因幼苗中报告基因的表达情况。大家好，我是来自马里兰大学细胞生物学与分子遗传学系Zou博士实验室的Chloe Mara。我是Wna gva，同样来自Dr.Z Chile的实验室。今天我们将向您展示用于转化拟南芥植株的花浸法，并演示如何检测转基因植株中报告基因的表达情况。我们的实验室通常采用这些步骤来研究基因表达和功能植物。现在让我们开始吧。在转化前约一个月开始此操作。将兔耳芥种子播种于4至8个5英寸见方的花盆中，每盆约10至15株，然后将播种后的花盆置于4摄氏度的冷室中处理3天，之后再放入植物生长培养室中。用于转化育性降低的拟南芥突变体植株。增加花盆数量，额外添加6至10个花盆。在标准条件下培养植株。若在较短日照或较低温度条件下培养，植株开花时间会延长，且需要更长时间才能达到适合转化的状态。良好的植株管理可确保植株健康，而健康的植株是成功转化的关键。建议在植物刚刚抽薹并开始开花时喷洒农药。此时植物已准备好进行转化，以提高转化效率。转化前3至4天，一旦植株抽薹，立即剪除主茎上发出荧光的嫩枝。为了在转化前两天促进更多的侧枝形成，将含有50 µg/mL卡那霉素的40 mL LB液体培养基接种农杆菌菌株GV3101（携带PTs oh2 Gus载体），在20至30°C的摇床培养箱中过夜培养。Gus基因被克隆至PIN20载体中，该载体同时携带卡那霉素抗性基因。TSO双启动子在转化前一天（即次日）驱动Gus的细胞周期调控表达。将8毫升过夜培养物转移至400毫升含有50微克/毫升的LB培养基中。同日，在28至30摄氏度的摇床培养箱中过夜培养。同时给植物浇水。这可以确保土壤不会吸收过多的水分。在转化当天进行花序浸润时，浸润介质的使用遵循了细菌在600纳米处的吸光度。当农杆菌培养物的 OD 600 达到约 0.8 时，在 4 摄氏度、5,000 RPM 条件下离心过夜培养物 8 分钟。将农杆菌沉淀重悬于 1 升新鲜配制的侵染培养基中。该培养基无需高压灭菌。将一升含有农杆菌的浸润培养基倒入一个8英寸×15英寸×2英寸的pyx玻璃培养皿中。接下来，我们将把植物浸入该浸润溶液中。操作过程中。需特别注意避免将花盆中的土壤浸入渗透溶液中。细

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