胚胎干细胞向少突胶质细胞前体的分化

以下实验的总体目标是通过为期30天的一系列培养步骤，从胚胎干细胞生成少突胶质细胞前体。该过程首先由小鼠ES细胞生成拟胚体，以启动细胞分化；第二步，用小分子化合物——视黄酸和纯吗啡处理拟胚体，诱导细胞定向分化为liga den。

细胞前体。第三步是在额外培养22天后，将胚胎小体解离为单个细胞。在培养中，约80%的细胞为少突胶质前体细胞（OPCs）。

接下来，将来源于MESC的少突前体细胞（OPC）用携带NAV 1.2亚基的bao病毒感染，以生成具有放电特性的OPC。通过免疫荧光显微镜和电生理记录获得的结果显示，这些来源于MESC的OPC表达了OPC标志物并具备放电特性。大家好，我是来自加州大学戴维斯分校细胞生物学与人体解剖学系Ing博士实验室的Pong Chiang。我们还与加利福尼亚北部的Shriners儿童医院有合作关系。

您好，我是来自邓实验室的 vial Raj。今天我们将向您展示一种将小鼠胚胎干细胞分化为少突胶质细胞前体细胞的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究胚胎干细胞来源的少突胶质前体细胞的特性，以期获得具有更佳治疗潜力的细胞。

那么我们开始吧。今天将从 OG2-GFP 小鼠胚胎干细胞系中生成少突胶质前体细胞（OPCs）。这些胚胎干细胞需要每三天传代一次，以保持其健康状态并维持最佳密度，防止自发分化。传代。

当 ESS 细胞在层流罩下达到 70% 汇合度时，移除培养基。用 PBS 洗涤，并加入两毫升预热的胰蛋白酶进行消化。

在37摄氏度下，以1× trip LE缓冲液处理五分钟。终止反应，并将细胞重悬于4毫升MES细胞培养基中。将细胞转移至15毫升圆锥形离心管中，在1000 ×g条件下离心五分钟以沉淀细胞。

将十分之一的细胞重悬于MESL培养基平板中，置于经照射的甲氨蝶呤饲养层细胞上，使用MES细胞培养基培养。三天后，胚胎干细胞（ES细胞）融合度约为70%，此时可进行传代，或悬浮培养以形成拟胚体，诱导分化。用胰蛋白酶消化小鼠ES细胞集落，操作同前，然后将细胞重悬于无血清替代物（knockout serum replacement，KSR）培养基中。使用血细胞计数板对细胞计数，并用KSR培养基稀释细胞悬液。

将中等浓度至每毫升15,000个细胞的悬浮液以每孔3毫升接种至超低吸附六孔培养板中。于37摄氏度培养4天，每两天完全更换一次培养基。

从第四天开始，每天更换培养基；在第四天更换培养基。第五天在KSR中添加0.2 µM视黄酸。第六天和第七天分别补充视黄酸和1 µM普里莫尔法明。用含有0.2 µM视黄酸和1 µM普里莫尔法明的两种培养基培养胚胎体。培养八天后，大多数胚胎体表达GFP，可进行消化、吹打分散，并像之前一样计数细胞。

然后用重悬液将细胞调整至每毫升3.5 × 10⁵个细胞的密度。在OPC培养基中，将3毫升该细胞悬液接种至培养皿中。使用多聚鸟氨酸包被的60毫米培养皿，大约每周传代一次，细胞将生长至融合状态，形态如下所示。按照之前的方法进行传代，使用胰蛋白酶消化3分钟。

原始复苏悬浮后第30天。在KSR培养基中，细胞表现出少突胶质前体细胞的特征，可生成有放电活性的少突胶质前体细胞（OPCs）。使用小鼠ESL来源的OPCs，细胞融合度应介于50%至70%之间。

更换为一种 XPBS 培养基以冲洗细胞。用于引入电压门控钠通道 1.2 α 亚基。

我们使用背部MAM钠通道试剂盒。将一毫升背部MAM组分A与四毫升1×PBS混合。吸除PBS冲洗液，加入稀释后的组分。

在37摄氏度下孵育两小时。按照试剂盒说明，用添加了组分B和C的OPC培养基替换原有的培养基。继续在37摄氏度下额外孵育两小时。

孵育后，将增强型培养基更换为新鲜的 OPC 培养基。再培养 24 小时后，可在该时间点对源自 ESL 的 OPC 进行放电活性检测。EBS 不显示任何 GFP 荧光。

EBS 在原始复苏悬浮后约 30 天表现出强烈的 GFP 表达，此时可进行解离培养。在 KSR 培养基中，大多数细胞对 NG2 染色呈免疫阳性，这与 GFP 表达一致。然而，与脑源性 OPCs 不同，这些由 MES 细胞衍生的 OPCs 即使在细胞去极化至 0 毫伏时也无法产生动作电位。

通过病毒转导引入 NAV 1.2 亚基后，这些由 MES 细胞衍生的少突胶质前体细胞（OPC）会被激活并产生动作电位。我们刚刚向您展示了如何将小鼠胚胎干细胞分化为少突胶质前体细胞（OPC），并通过病毒转导生成可产生电活动的 OPC。进行该操作时，需注意妥善保存视黄酸、吗啡类物质和 FGF2，并始终使用新鲜分装的试剂，使用后应丢弃剩余的视黄酸。

以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。