Name: 建立颅内脑肿瘤异种移植肿瘤的生长和对治疗的反应与后续利用生物发光成像分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-13T17:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 学习建立颅内脑肿瘤异种移植模型，通过生物发光成像实时监测肿瘤生长和治疗反应。该方法利用荧光素酶修饰的人脑肿瘤细胞进行颅骨注射，为神经肿瘤学临床前研究提供可靠的疗效评估工具。

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NINDS 资助项目编号 NS49720 和 NS65819，NCI 资助项目编号 CA97257

1. 肿瘤细胞制备。
人脑肿瘤异种移植的细胞可来源于在裸鼠体内以皮下生长方式传代的肿瘤，也可来源于细胞培养。下文将讨论这两种细胞来源的使用方法，并演示一种细胞植入技术。
为将皮下肿瘤细胞制备用于颅内移植，切除的侧腹肿瘤组织被置于培养皿中，首先使用手术刀将组织切碎，随后通过反复吹打进行机械性解离，以制备细胞团悬液1。将细胞团悬液经70 μM尼龙滤网过滤，获得适用于颅内注射的单细胞悬液。细胞悬液在4°C条件下以1000 rpm离心10分钟，吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于适当体积的无血清培养基中，以获得最终工作浓度（见下文）。对于已建立的细胞系进行颅内移植前的制备，可通过胰酶消化单层细胞，或收集神经球悬浮培养物，随后按上述方法离心并重悬细胞2。注射细胞数量根据注射部位的神经解剖位置而有所不同。对于幕上区域注射，常规注射3–5 × 105个细胞于3 μL无血清培养基（DMEM）中；而对于脑干注射3，则可在0.5 μL中注射低至5 × 104个细胞。注射体积超过推荐值可能导致肿瘤细胞沿针道反流，从而引起外生性生长（图1），而非颅内肿瘤生长。在取出用于颅内注射的样本后，剩余细胞悬液应置于冰上，并在完成同一批次动物的颅内成瘤操作期间频繁混匀，以维持适当的细胞浓度。
2. 肿瘤细胞移植
请注意，下述所有操作步骤均已通过加州大学旧金山分校机构动物使用与护理委员会的审查和批准。
<ol>
	<li>应使用消毒剂（如 2% 氯己定溶液）喷洒手术区域的所有表面以进行准备。使用消毒剂后，应将以下物品放置于手术区域：
	<ul>
		<li>加热垫，用于维持小鼠体温</li>
		<li>两个小型培养皿；一个盛有 3% 过氧化氢，另一个盛有 2% 氯己定</li>
		<li>无菌纱布和棉签</li>
		<li>无菌一次性手术刀</li>
		<li>经高压灭菌的外科缝合器</li>
	</ul>
	</li>
	<li>麻醉应采用注射麻醉剂，通常使用氯胺酮-赛拉嗪混合物。</li>
	<li>小鼠麻醉后，用浸有氯己定溶液的无菌纱布反复擦拭头皮进行消毒。术中应涂抹眼膏以维持角膜适当的湿润度。使用无菌手术刀在顶枕骨区域做长约 1 cm 的矢状切口。随后用浸有 3% 过氧化氢溶液的棉签清洁暴露的颅骨表面。此时应能清晰看到前囟（见视频）。</li>
	<li>肿瘤细胞注射的坐标取决于期望的成瘤部位。以下为我们用于建立颅内肿瘤模型的注射方法2，该位置是许多脑肿瘤患者常见的肿瘤发生区域。脑肿瘤研究中的其他感兴趣区域包括脑桥，用于脑干肿瘤的解剖学建模3，以及硬膜下注射，用于模拟脑膜肿瘤的位置4。在注射肿瘤细胞前，使用无菌的 25 号锐利针头在前囟右侧 2 mm、冠状缝前方 1 mm 处穿刺颅骨，以形成细胞注射孔（见视频）。该方法在小鼠和大鼠中均适用（大鼠使用 22 号针头）。</li>
	<li>在将细胞吸入注射器前，轻轻弹击细胞悬液管壁以混匀内容物。小心吸取所需体积的细胞悬液，避免产生气泡。随后用酒精棉片擦拭注射器外表面，去除可能附着的细胞，以防止颅外成瘤和肿瘤生长（图 1A）。为确保准确的注射深度，使用手术刀将 P20 移液器吸头尖端切去 3 mm。该截短的吸头可套在注射器上，用于限制进针深度，并确保注射器针尖距离颅骨内表面 3 mm。将注射器垂直插入先前打好的孔中，缓慢注入细胞悬液（3 μL 悬液应在 1 分钟内完成注射）。注射角度不当可能导致细胞注入脑室内，并引发脊髓播散（图 1B：右侧）。注射完成后，将针头留置原位 1 分钟，然后缓慢拔出（见视频）：这些步骤有助于减少肿瘤细胞反流。</li>
	<li>作为非辅助或徒手进行颅内肿瘤细胞植入5的替代方法，可使用小型动物立体定位仪（示意图中的 F 面板），该方法通常可提高注射位置的一致性，但会显著增加操作时间。根据我们的经验，两名手术人员采用徒手方法每小时可注射多达 60 只小鼠，而使用小型动物立体定位仪的最大注射速率为每小时约 15 只小鼠。在需要注射大量小鼠时，操作效率是一个重要考虑因素，有助于缩短肿瘤细胞在冰上保存的时间。</li>
	<li>用 3% 过氧化氢清洁颅骨，并用无菌干棉签擦干。将无菌骨蜡涂抹于钻孔处。使用镊子将头皮拉拢覆盖颅骨，并用缝合钉闭合切口。为获得最佳愈合效果，应使头皮两侧的真皮层相对贴合（即内侧对内侧）。缝合后的头皮应用氯己定溶液清洁，随后通过皮下注射给予布托啡诺以缓解术后疼痛。</li>
	<li>所有小鼠术后均需密切监测，直至其恢复自主活动并表现出正常行为。通常恢复时间约为 30 分钟。</li>
	</ol>
3. 肿瘤生长的生物发光监测
<ol>
	<li>背景。生物发光成像（BLI）基于在氧气和三磷酸腺苷（ATP）存在下，荧光素（d-(-)-2-(60-羟基-20-苯并噻唑基)-噻唑-4-羧酸）的氧化反应。该反应由荧光素酶催化，将化学能转化为光子，从而发射出光。人类细胞可被改造以表达荧光素酶（见下文），只有表达荧光素酶的细胞在荧光素底物存在时才能发光。经荧光素处理的动物宿主自身产生的背景发光极低，因此检测荧光素酶修饰的肿瘤细胞所发出的发光信号具有非常理想的信噪比，可在活体中高灵敏度地监测肿瘤生长及对治疗的反应。此外，已有研究表明荧光素酶及其底物荧光素对哺乳动物细胞无毒性，我们亦未观察到表达荧光素酶的细胞与其相应的未修饰细胞之间存在功能差异。荧光素在小鼠经腹腔（i.p.）或静脉（i.v.）注射后可迅速穿过细胞膜和血脑屏障，从而实现对含有荧光素酶修饰细胞的所有组织区域进行成像。荧光素酶修饰细胞所发射的光子强度和光谱范围足以穿透小动物（如小鼠和大鼠）的组织，并可通过低光照成像相机从体外检测。生物发光成像的非侵入性特点使得可在同一动物个体中反复监测肿瘤生长及对治疗的反应。</li>
	<li>植入的细胞来源应稳定表达萤火虫荧光素酶。此类细胞来源可直接购买，或由各实验室使用构建用于组成型表达荧光素酶的慢病毒自行制备。我们强烈建议使用荧光素酶编码慢病毒感染的细胞，而非质粒转染的细胞，以确保在体内实现荧光素酶的稳定细胞表达，这对于在实验过程中对同一动物个体进行多次成像时，通过定量发光成像准确反映肿瘤负荷的变化至关重要。</li>
	<li>BLI监测。我们建议在肿瘤细胞注射后一周开始，每周进行1至2次定量生物发光成像（qBLI）。我们的qBLI使用IVIS Lumina成像系统（Caliper Life Sciences），实验结果表明，使用IVIS Lumina、IVIS 150或IVIS 200成像系统均可获得相似的数据。成像前，小鼠同时接受氯胺酮/赛拉嗪麻醉，并通过腹腔注射给予荧光素（D-荧光素钾盐，150 mg/kg，Caliper Life Sciences），注射后12分钟进行成像。荧光素的药代动力学表明，为获得最大发光强度和最高检测灵敏度，应在注射荧光素后10至15分钟内测定细胞发光信号。在10至15分钟的时间窗口内所选择的具体时间点应在所有成像动物之间保持一致。保持从注射荧光素到获取BLI读数之间的时间间隔恒定极为重要。使用Living Image软件定义包含颅内信号区域的兴趣区（图2），并记录总光子数/s/sr/cm²（每秒每球面度每平方厘米的光子数）（见视频）。</li>
	<li>数据分析。尽管肿瘤生长和治疗反应是在个体动物中进行监测，但我们强烈建议每组治疗组至少包含8只动物，以提高关于肿瘤对治疗有无反应的结论的统计学可靠性。在展示qBLI结果时，将每只小鼠在治疗期间及治疗结束后获得的发光值除以其相应的治疗前最大发光值，从而转换为归一化数值6,7。对于生存分析，采用Kaplan-Meier估计法8生成生存曲线，并确定中位生存时间。不同生存曲线之间的差异通过log-rank检验进行比较9。</li>
	<li>治疗与未治疗肿瘤脑组织的取材以供后续分析。在动物安乐死后，应迅速取出小鼠脑组织（见视频），可将其置于福尔马林中用于后续肿瘤形态学和免疫组织化学分析，或包埋于OCT包埋剂中进行冷冻保存。</li>
	</ol>
4. 代表性结果
在图3A所示的示例中，接受颅内肿瘤细胞注射的小鼠通过监测颅内生物发光信号，直至连续的平均发光值表明肿瘤呈进行性生长，此时开始治疗（灰色箭头起始于第34天：每日给予150 mg/kg厄洛替尼，直至需要实施安乐死）。每只小鼠在治疗开始时的发光值被归一化为1，后续每次成像的发光值均以其治疗前最后一次成像的发光值为基准进行归一化处理。例如，某只小鼠在第34天治疗前的最终发光读数为2.0 × 107 光子/秒，到第38天时发光值上升至6.0 × 107 光子/秒，则该小鼠在第38天的归一化发光值为3.0。针对每次成像时间点，分别绘制对照组与治疗组的平均归一化生物发光值及其对应的标准误。在此示例中，治疗开始后的首次成像时间点（第38天）即可见两组间平均归一化发光值存在显著差异，且后续时间点的组间平均发光值差异进一步增大。在大多数情况下，qBLI所反映的治疗抗肿瘤活性会伴随生存期出现相应的显著差异（即 p &lt; 0.05），本例即如此（图3B）。图3C和3D显示的是小鼠安乐死后获取的脑组织相邻切片，经甲醛固定、石蜡包埋并切片后，分别进行苏木精-伊红（H&E）染色和抗EGFR免疫组化染色的结果。
<img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="裸鼠肿瘤成像；示意图；光学荧光；肿瘤位置及示踪剂分布。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 颅内注射错误的指征。A) 外生性（颅外）肿瘤生长（红圈）可能由注射体积过大、细胞悬液残留在注射器针头、或注射肿瘤细胞后过快拔出注射器所致。B) 若将肿瘤细胞注入脑室，可导致肿瘤沿脊髓播散（右侧小鼠）；而正确注射的肿瘤细胞信号则局限于注射部位（左侧小鼠）。
<img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="生物发光成像，对照组与处理组，颜色标尺表示信号强度，实验。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 治疗反应实验中对照组（左）和处理组（右）代表性小鼠的生物发光强度热图图像表示。Living Image 软件可设置以定义感兴趣区域（红色圆圈），或由仪器操作人员手动定义感兴趣区域。在使用此类图像进行图示构建时，我们建议仪器操作人员采用相同的生物发光热图范围（图的上部）显示热图图像，以便直观展示不同实验动物之间生物发光差异的程度。
<img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt="厄洛替尼作用图示、组织学染色、PTEN、EGFR在癌症研究中的分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 显示治疗反应的实验中的生物发光、生存率及肿瘤组织分析。A) 对照组与治疗组小鼠的平均生物发光读数曲线图，每个成像时间点均标示标准误。B) 同一批小鼠的生存曲线图；p值通过log-rank检验确定7。C) 含肿瘤的小鼠脑组织H&amp;E染色切片。D) EGFR染色切片。E和F) 分别为C和D图中指定区域的放大图像，其中E图显示肿瘤抑制蛋白PTEN呈阴性染色。

<ol><li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li>
<li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li>
<li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzawa%2C+T+%22CNS+Cancer%3A+Models%2C+Markers%2C+Prognostic+Factors%2C+Targets%2C+and+Therapeutic+Approaches%22">CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches</a>. Van Meir, E. , Humana Press-Springer. New York, NY. 147-162 (2009).</li>
<li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li>
<li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Stat.+Soc.+Ser.+A.+Stat.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li>
<li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression%3A+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

原位（颅内）脑肿瘤异种移植模型的建立为中枢神经系统癌症的治疗反应研究提供了合适的微环境10。此类模型还可提供有关治疗药物进入脑组织及脑肿瘤的信息，这对于判断实验性药物是否应推进到临床试验阶段至关重要。由于颅内异种移植肿瘤的体积无法像皮下肿瘤那样通过游标卡尺直接测量，因此对颅内肿瘤生长及其治疗反应的纵向监测需要依赖非侵入性影像技术；根据我们的经验，当实验的主要目标是评估肿瘤对治疗的反应程度时，生物发光成像是一种最为实用的方法。当生物发光成像结果与动物生存分析相结合时，这两组数据可为评估实验性治疗效果提供一种强大且可靠的方法。
最后，为了评估治疗对肿瘤形态学和分子水平的影响，必须在动物安乐死后立即获取颅内脑肿瘤异种移植组织；为此，我们更倾向于在实施安乐死时进行全脑切除，并保存切除的脑组织以供后续分析。
尽管前述内容主要针对脑肿瘤研究，但这些概念显然可推广至其他适用于啮齿类动物原位建模的人类癌症。

<table><tbody><tr><td>一次性手术刀</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>No.21</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>2% 氯己定</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td></td></tr><tr><td>3% 过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td></td></tr><tr><td>25g 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>10 µl Hamilton 锐利微量注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>20734</td><td></td></tr><tr><td>皮肤缝合器及缝合钉</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 软件</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1G</td><td>钾盐</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

建立颅内脑肿瘤异种移植模型并利用生物发光成像分析肿瘤生长及治疗反应

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

多年来，利用人脑肿瘤细胞的移植模型在神经肿瘤学研究中发挥了重要作用。过去，建立人源肿瘤异种移植模型最常用的方法是从培养瓶中收集细胞，随后将收集的细胞注射到免疫缺陷小鼠的皮下。尽管该方法目前仍在许多实验室中广泛使用，但在过去十年中，研究重点已显著转向原位异种移植模型的建立，对于脑肿瘤而言，这需要将肿瘤细胞注射到相应的神经解剖结构中。由于颅内异种移植无法通过直接测量（如使用游标卡尺）来监测肿瘤生长情况，因此对原位脑肿瘤异种移植模型的重视促使研究人员必须采用非侵入性成像技术来评估宿主动物体内的肿瘤负荷。在目前可用的成像方法中，生物发光检测通常被认为在灵敏度、操作便捷性和成本方面具有最佳的综合优势。本文中，我们将演示原位脑肿瘤模型的建立过程，以及在测试实验性疗法时监测肿瘤生长及其对治疗反应的方法。

可通过颅内接种在裸鼠体内建立表达荧光素酶的人脑肿瘤异种移植模型，并利用生物发光成像技术对肿瘤生长及治疗反应进行后续监测。结合生存分析，生物发光监测是针对脑肿瘤治疗方案开展临床前研究的重要工具。

多年来，使用人脑肿瘤细胞的移植模型在神经肿瘤学研究中发挥了重要作用。过去，最常用的……

多年来，使用人脑肿瘤细胞的移植模型主要采用在免疫缺陷小鼠体内进行皮下注射的方法。近年来，研究趋势已转向将细胞注射至相应的解剖结构中，即脑部。在本视频文章中，通过在小鼠颅骨上钻孔并使用针头注射经生物发光成像改造的肿瘤细胞，建立颅内肿瘤模型。手术后，监测肿瘤生长速度及对治疗的反应。利用生物发光成像系统，结合生存分析以及组织病理学和蛋白质表达分析，所得数据可用于评估实验性脑肿瘤疗法的有效性。该方法有助于解答神经肿瘤学领域的关键问题，例如抗肿瘤药物是否能够进入大脑。该技术的应用意义在于推动脑肿瘤患者的治疗，因为我们正在治疗在动物宿主体内生长的人脑肿瘤。在超净工作台内进行操作，将皮下肿瘤细胞制备好，以便移植至颅内腔室。首先将切除的 flank 肿瘤组织放入组织培养皿中。使用解剖刀将组织切碎，然后使用移液器通过机械方法破坏组织，以制备细胞团悬液。接下来，将细胞团悬液通过带有70微米尼龙滤网的滤器，并收集到圆底试管中。重复此过程，共计三次，以获得适合颅内注射的单细胞悬液。在4°C条件下，以1000 RPM离心10分钟，离心后吸除上清液，然后将细胞沉淀重悬于适量的无血清培养基中，以获得最终工作浓度，作为皮下肿瘤解离的替代方法。可从含有已建立的脑肿瘤细胞系的细胞培养物中收获肿瘤细胞。通过胰蛋白酶消化结合离心法收集细胞。离心后，将细胞重悬于适量无血清DMEM中，用于徒手进行幕上注射。每3微升体系中加入3至5×10⁵个细胞。使用2%氯己定喷洒所有表面，对手术区域进行消毒。接下来将以下物品放入手术区域：用于维持小鼠体温的加热垫，两个小型培养皿（一个装有3%过氧化氢，另一个装有2%氯己定）、无菌纱布和棉签、无菌一次性手术刀片以及高压灭菌的外科缝合钉合器。使用氯胺酮和甲苯噻嗪混合物使小鼠麻醉后，用浸有氯己定的无菌纱布多次更换手术区域。在操作过程中使用眼膏以保持适当湿润。使用无菌手术刀，在枕骨旁区域做一长约一厘米的矢状切口。使用浸有3%过氧化氢溶液的棉签清洁暴露的颅骨表面。此时应可见脑膜血管（bgma），以便为肿瘤细胞注射创建开口。使用无菌的25号锐利针头穿刺颅骨。位于bgma右侧2毫米、冠状缝前方1毫米处。通过轻弹混匀细胞悬液中的内容物。用所需量的细胞悬液装填注射器。避免产生气泡。用酒精棉片擦拭注射器外部，以去除附着的细胞。这有助于防止颅外肿瘤的形成和生长，同时确保达到适当的注射深度。如果不使用小型动物立体定位仪，可用手术刀将P20移液器吸头的尖端切去3毫米。将切下的吸头部分套在注射器上，以限制注射深度，确保注射针尖距离颅骨下表面3毫米。因此，接下来的步骤可能是整个操作方法中最具挑战性的环节，尤其是在进行以下注射时，恰当的死亡状态控制以及递送的准确性至关重要，以确保肿瘤能够在脑内正确的位置成功建立并生长。接下来，将注射器垂直于颅骨插入孔中，并缓慢注入细胞悬液。注入体积过大可能会导致肿瘤细胞经针道反流，从而引起脑外而非颅内肿瘤生长。如图所示，注射器插入角度不当可能导致细胞注入脑室内，进而在注射完成后出现脊髓播散。将针头留置原位一分钟，然后缓慢拔出。这些步骤有助于防止肿瘤反流。用3%过氧化氢清洁颅骨并晾干。使用无菌棉签。用镊子将无菌骨蜡涂抹于孔洞处。将头皮两侧的真皮层对合，背侧与背侧相贴，拉拢覆盖颅骨并用钉皮器固定。然后使用氯己定清洁头皮。通过皮下注射给予布托啡诺，以缓解术后疼痛。尽管此处未展示，布托啡诺可被迅速吸收。继续注射其他小鼠。每次注射之间务必混匀细胞，以维持同一批次注射小鼠间细胞浓度的一致性。建议每组处理组至少包含八只小鼠，以确保获得具有统计学意义的结果。术后监测所有小鼠，直至其能够自主活动并恢复正常的活动状态。通常在肿瘤细胞注射后一周开始，恢复时间约为30分钟。应每周进行一次或两次定量生物发光成像（QBLI）。此处。使用 IVIS Lumina 成像系统和 Living Image 软件版本 3.2 进行 QBLI 实验。从 Windows 开始菜单中选择 Living Image 软件程序。程序启动后，点击相机控制面板中的初始化 IVIS 系统按钮。初始化完成后，温度状态框应显示为绿色，表明CCD相机已充分冷却。将麻醉并注射了荧光素酶的实验小鼠放置于成像室的载物台上。打开成像会话中保存的文件之一，并将图像数据显示单位从计数转换为光子数。为确定目标信号的每秒光子数，请从ROI下拉菜单中选择圆形图标。目标信号周围应出现标记为ROI的兴趣区域。应将信号录入Excel文件中，文件中需注明动物编号和成像日期。在本次成像过程中，对所有分析的动物重复此操作序列。在获取每只成像小鼠的光子计数并将光子数值导入 Excel 文件后，通过将每只小鼠在治疗方案进行期间及完成之后所获得的生物发光值除以其相应的治疗前最大生物发光值，将生物发光读数转换为归一化数值。为使用 Prism 软件进行生存分析，采用 KAPLAN-Meier 估计法生成生存曲线，并估算中位生存时间。使用对数秩检验（log rank test）比较生存曲线之间的差异。如果动物健康状况出现明显下降，特别是体重减轻超过最大体重的20%，应实施安乐死。迅速取出安乐死后小鼠的脑组织，随后将脑组织置于甲醛中，用于后续肿瘤形态学及免疫组织化学分析。本示例显示了接受颅内肿瘤细胞注射治疗并在第34天开始厄洛替尼治疗的小鼠的平均归一化发光值。误差线表示标准误，首次治疗后成像时间点即可观察到平均归一化发光值存在显著差异。在大多数情况下，各组平均发光值的差异在后续时间点进一步增大。通过QBLI显示的治疗诱导的抗肿瘤活性伴随着生存率的显著差异。在此情况下，对石蜡包埋的小鼠脑组织切片进行苏木精和伊红染色，可显示肿瘤细胞的分布模式。P 10 是常与肿瘤对EGFR抑制反应相关的标志物。此处。经处理的肿瘤细胞中可见P 10表达缺失，表现为缺乏棕褐色染色。此处显示的是石蜡包埋的小鼠脑组织切片。EGFR抑制剂敏感的脑肿瘤细胞可通过棕褐色的EGFR染色进行识别。正如您所见，该实验操作中最具有挑战性的环节是肿瘤细胞的正确注射。利用这种方法还可以进一步开展哪些实验？例如，研究对肿瘤细胞进行基因修饰后对其生长特性的影响？以上就是全部内容。希望本次演示对您有所帮助。祝您的实验顺利成功。

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建立颅内脑肿瘤异种移植肿瘤的生长和对治疗的反应与后续利用生物发光成像分析

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来源：Clark, A.J., 等. 胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像。J. Vis. Exp.

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使用立体定位仪建立脑肿瘤患者来源异种移植原位模型

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学习建立颅内脑肿瘤异种移植模型，通过生物发光成像实时监测肿瘤生长和治疗反应。该方法利用荧光素酶修饰的人脑肿瘤细胞进行颅骨注射，为神经肿瘤学临床前研究提供可靠的疗效评估工具。

建立颅内脑肿瘤异种移植模型并利用生物发光成像分析肿瘤生长及治疗反应

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