Name: 果蝇胚胎的体内离心 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 学习利用体内离心技术在活果蝇胚胎中按密度分离细胞器的方法。该技术可避免体外分离造成的假象，便于进行共定位实验和生化分析，为细胞生物学研究提供可靠手段。

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我们感谢 Susan Gerbi、Heidi Smith 和 David Lambert 提供用于测试的材料 体内 离心处理 Sciara coprophila 和 Ilyanassa obsoleta分别表示。感谢Welte实验室成员对本技术及手稿提出的宝贵意见。该技术的开发与优化 体内 离心实验由NIGMS基金GM64687（资助给MAW）支持。图1以及图5E、F中所示图像此前已发表。2 并经许可在此重印。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

关键步骤
确保琼脂浓度足够高。 如果浓度过低，琼脂在离心过程中会解体，导致胚胎破裂或方向紊乱。如果琼脂浓度略低，或琼脂过湿（在步骤 4.3 中干燥不充分或未充分去除多余的 TSS），胚胎会在离心过程中从孔中浮出，造成方向不正。如果琼脂铺得过薄，在离心过程中也会塌陷或开裂。
确保胚胎未发育超过细胞化阶段。 否则，细胞器的分离将无法进行（图5C），因为细胞器会被封闭在成千上万个独立的细胞内。在单细胞阶段的较年轻胚胎中，细胞器可自由长距离迁移，并根据其特征密度进行富集。为避免分析过老的胚胎，需确保做到以下几点：（i）进行预收集以使雌蝇产掉陈旧卵（步骤2.4）；（ii）收集胚胎时间不超过3小时（步骤2.5）；（iii）在包埋琼脂前肉眼挑选处于细胞化阶段之前的胚胎（步骤4.2）；（iv）缩短包埋时间，防止胚胎发育至细胞化结束（步骤4.6）；（v）弃去分层不正确的胚胎（步骤5.6）。
切勿缩短离心时间。 尽管部分胚胎在仅离心10分钟后即可显示出良好的分层效果，但不同胚胎之间的分离效果不一致。离心30分钟可获得高度一致的结果。此外，离心时间越长，离心结束后各层的稳定性也越持久。这对于那些在使用前需要较长时间进一步处理胚胎的应用尤为重要（例如，若胚胎需用于移植实验或制备共聚焦显微镜分析样品）。
可能的修饰
卵的收集与卵壳去除 针对步骤 2 和步骤 3，存在多种不同的实验方案1, 3, 9，只要所使用的胚胎处于早期发育阶段、产卵量高且发育阶段错误的胚胎比例尽可能低，这些方案均可获得与本文所述相当的效果。
前后轴对齐 该实验方案将所有胚胎定向，使后端埋入琼脂中，前端朝上（图3）。这种方向性有利于保持一致性，从而可以在离心过程中利用动孔作为解剖标志来判断哪一端朝上（图1，5）。然而，经过练习后，通过明场显微镜观察脂滴层和卵黄层的明显形态差异，很容易辨别离心后胚胎的方向。因此，可以灵活地以任一端朝上的方式封片；这种灵活性可加快封片过程。
非定向离心 该实验方案中最耗时且技术上最具挑战性的步骤是将胚胎固定在琼脂中（步骤4）。此过程需要接触每个胚胎两次（一次是将其插入孔中，另一次是在离心后回收）。作为替代方法，可以在步骤4.1中将胚胎转移至装有TSS的微量离心管中。当这些管子在微量离心机中离心（13,000 rpm，10–30分钟）时，胚胎通常也能形成良好的分层10–13。这种变通方法可实现同时快速处理数百个胚胎。然而，分层效果的一致性较差；尽管施加的离心力远高于上述方案（约16,000 g），仍有部分胚胎无法形成清晰的分层。更具挑战性的是，胚胎的朝向具有可变性，可观察到其分离方向相对于胚胎主轴呈不同角度。这种变异性要求实验人员在离心后判断每个胚胎在离心管中的具体排列方式。利用卵黄的自发荧光作为胚胎最致密部分的标记，通常可以实现这一判断，但需要大量实践经验以及较强的主观判断能力才能可靠完成。如果样本中胚胎数量足够，可能可以筛选出那些恰好如图1所示方式排列的胚胎。
在卵壳中对胚胎进行离心 在第4步中，可以不先去除卵壳（chorion）而直接将胚胎包埋于琼脂中2。在此方法中，第3.2步使用卤代烃油覆盖收集板上的胚胎，代替50%次氯酸钠溶液（卤代烃油可使卵壳变为半透明）。选择处于合适发育阶段的胚胎，用镊子将其转移至新的琼脂板；操作时仅夹取卵丝部分，以避免损伤胚胎本体。随后按照第4.4至4.8步的方法将胚胎包埋，使前端的卵丝从琼脂孔中露出。在胚胎经离心并按第5.4步从琼脂中挖出后，再通过50%次氯酸钠处理去除卵壳。在保留卵壳的情况下进行离心，可能有助于提高固定后（第6.2步）去卵黄膜的效率，但为离心选择正确发育阶段的胚胎（第4.2步）会更具挑战性。
应用
胚胎离心对于共定位实验特别有用，例如用于检测某种特定蛋白质是否定位于某一主要细胞器。例如，Klar蛋白存在于早期胚胎的脂滴上，但这种定位在完整胚胎中难以证明。部分原因在于Klar斑点和脂滴在胚胎外围均十分丰富10，使得偶然共定位难以排除。然而，离心可将脂滴浓缩成一个明显的层次，从而使Klar信号的共定位变得清晰可见10。
类似分析已明确证实其他蛋白质定位于脂滴8, 13-15，其中包括一些出人意料的例子，如某些组蛋白2，以及某些在细胞中普遍存在但在脂滴上富集的蛋白质8。由于可凭视觉根据发育阶段选择胚胎（步骤4.2），甚至能够检测到蛋白质在发育调控下向脂滴的募集8, 15。检测与脂滴的共定位尤为简便，因为脂滴在离心后会形成视觉上明显的“帽状”结构，因此无需额外的标记物或染色即可识别该层。事实上，由于该方法操作简便且可能获得显著的视觉结果（图1，图5 D、E），本实验室现已常规采用该技术作为初步检测候选蛋白质是否定位于脂滴的方法。原则上，类似的共定位研究也应适用于图1中所示的其他细胞器，以及可能包括尚未在离心胚胎中明确分布的细胞内寄生虫在内的其他结构。
由于离心可将细胞器浓缩成紧密的条带，因此有助于分离富含这些细胞器的组分。该方法已用于回收脂滴并移植到受体胚胎中2。也有可能对富集的组分进行生物化学分析（例如，在固定后切取胚胎的不同层次进行分析15）。
此处所述方法的应用范围不限于 果蝇 胚胎，因为离心可用于对多种不同物种的卵进行分层（包括青蛙、线虫、被囊动物、环节动物、海胆、软体动物和刺胞动物） 16在我们自己的实验室中，已将上述方案用于家蝇的胚胎 家蝇 2 并采用无定向离心法分析了真菌蚊胚胎 Sciara coprophila 17 和蜗牛 Ilyanassa obsoleta 17最后，该方法不仅限于胚胎：离心也可用于分层其他大型细胞，例如卵母细胞（如 黑腹果蝇 2, 18 以及马利筋虫 Oncopeltus fasciatus 17）。对于不同样本，离心条件需进行优化：例如，3000 × g 离心10分钟足以有效分层胚胎 家蝇 2，如果离心时间过长，胚胎在固定和免疫染色过程中容易破裂。

<table><tbody><tr><td>60x15 mm 培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>来自 Falcon</td></tr><tr><td>金属丝网</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>304 型不锈钢；网目规格 #150 x150，金属丝直径：0.0026 英寸</td></tr><tr><td>钨针</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0.25 mm</td></tr><tr><td>Moria 镍镀针/针头夹持器</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>果蝇饲养笼</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 或 59-101</td><td>分别用于直径为 65 mm 或 100 mm 的培养皿</td></tr><tr><td>卤代烃油 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

体内 离心 果蝇 胚胎

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

分离和纯化不同类型细胞内细胞器的一个主要策略是根据其浮力密度的差异进行分离。然而，在离心前细胞被破坏后，蛋白质和细胞器在此非天然环境中常常发生非特异性地相互黏附。本文描述了一种在完整、活体的Drosophila胚胎中按密度分离细胞器的方法。在细胞化之前的早期胚胎从群体培养笼中收集，通过50%次氯酸钠处理去除其外部卵壳。随后将胚胎转移至一小块琼脂平板上，并以尾端朝前的方式插入琼脂中的微小垂直孔洞中。将含有嵌入胚胎的琼脂板在3000g条件下离心30分钟。琼脂可支撑胚胎并使其保持固定的取向。离心后，用钝针将胚胎从琼脂中取出。 离心分离可将主要细胞器分层，形成在明场显微镜下清晰可见的分层结构。已有多种荧光标记物可用于验证活体胚胎中分层是否成功。与特定细胞器相关的蛋白质将在某一特定层中富集，从而显示共定位现象。各个分层可被分别回收，用于生化分析或移植至受体卵中。该技术适用于其他大型细胞中的细胞器分离，包括多种物种的卵细胞和卵母细胞。

我们描述了一种在活体果蝇（Drosophila）胚胎中按密度分离细胞器的方法。将胚胎包埋于琼脂中并进行离心。该技术可沿胚胎的头尾轴方向实现主要细胞器的可重复分离。此方法有助于共定位实验，并可获得用于生化分析及移植实验的细胞器组分。

一种纯化和分离不同类型细胞内细胞器的主要策略是根据它们在密度、大小和形状等方面的差异进行分离。

通过密度分离果蝇卵内主要细胞器的方法首先需要收集不到三小时龄的胚胎。去除卵壳时，需在50%漂白剂中孵育，脱胶处理后进行。具有明确发育阶段的胚胎被固定在琼脂中。最后一步，对胚胎进行离心并回收，利用亮光和荧光观察回收的胚胎。显微镜观察显示特定蛋白质定位于某些细胞器。纯化和分离细胞内细胞器的主要策略是根据密度将它们与其他所有细胞组分分离开来，但存在一个挑战：在离心之前细胞已被破坏，导致通常相互分离的蛋白质和细胞器混合在一起。在这些非天然的体外条件下，玉米籽粒可能会相互粘连。相反，某些蛋白质可能会从它们通常结合的结构上脱落。我们将要描述的技术的主要优势在于，它能够在体内按密度进行分离。因此，该方法避免了细胞破裂及其带来的假象。此方法有助于回答关键的细胞生物学问题，使共定位实验变得非常简便，并可分离特定的细胞器组分，用于移植实验及生物化学分析。在此实验步骤中，制备含有苹果汁的高浓度琼脂培养基，并按照随附的书面实验方案详细说明将其倒入培养皿中。这些培养皿将用于产卵步骤以及后续的胚胎包埋和离心。本实验程序首先开始收集卵。首先，通过将干酵母与水混合至类似花生酱的稠度来制备酵母糊，然后用该酵母糊覆盖部分新鲜的苹果汁琼脂平板。将成年果蝇饲养在笼中，笼底固定有琼脂平板。要移除当前的培养板，请将果蝇培养笼倒置并轻敲实验台面。轻敲数次后，果蝇会掉落至底部，并在此极短时间内暂时失去方向感。请迅速将旧的琼脂板更换为涂有酵母糊的新鲜培养板。酵母为卵子生成提供营养，并与琼脂中的苹果汁共同诱导产卵。弃去最初30至60分钟内收集的卵子，因为这些卵子在受精后被雌性滞留，会导致大量胚胎发育时期不准确。后续的卵收集通常以受精后不久产下的卵为主。收集卵的时间不超过三小时，因为在年轻胚胎中，此时卵层分布最为一致。更短的收集时间（一小时或更短）更为理想。对于常规实验，使用镊子移除粘附在酵母或琼脂平板表面的果蝇。收集卵后，继续去除卵壳，将琼脂平板置于解剖显微镜下，通过透射照明观察胚胎。务必识别卵丝结构，以从胚胎上完整去除卵壳。在琼脂平板下注入50%的漂白剂，覆盖胚胎，并孵育数分钟。偶尔轻轻晃动琼脂平板，使胚胎在漂白剂中旋转。再次在显微镜下检查卵子。当卵丝状物不再可见时，表明已成功去除珊瑚藻。此过程通常需要在漂白液中孵育三到五分钟。接下来，使用金属丝网篮作为筛子，将胚胎与漂白液分离。用一块边长为两厘米的方形金属网平面片，在中间压出凹痕，制成篮状。用镊子夹住金属丝篮，将其悬于琼脂平板倒置的盖子上方。将琼脂平板上的漂白液和胚胎混合物倒入金属网中，使液体经网孔滤入琼脂平板的盖内。若胚胎仍留在琼脂平板上，可向平板中喷入蒸馏水以使其脱离，并将蒸馏水与胚胎混合液倒入金属筛网中过滤。将金属筛网底部轻触纸巾，吸去多余液体。然后沿金属筛网边缘喷洒蒸馏水，冲洗残留的次氯酸钠溶液，同时尽量减少胚胎的损失。经常吸去多余液体。重复洗涤步骤5到10次，直至所有漂白剂完全去除。如果金属丝篮仍有漂白剂气味，需继续清洗胚胎。胚胎充分洗净后，即可将其置于琼脂中进行封片。将胚胎从金属网篮中用TSS缓冲液冲洗至空的培养皿中，胚胎应会沉入底部。在解剖镜下通过透射光观察胚胎。特定发育阶段可直观识别。使用 P 200 移液器挑选所需阶段的胚胎，并将其转移至小型琼脂平板上。操作需迅速，因为胚胎在不断老化，且在TSS中浸泡超过30分钟可能会影响发育。在Kimwipe纸下用移液器吸除大部分TSS。琼脂表面应略微湿润，这有助于推动胚胎。然而，培养皿表面任何位置都不应有液体积聚，因为在离心过程中多余的液体将导致胚胎从孔中滑出。该操作中最困难的环节是固定胚胎和螺旋推进器。这尤其具有挑战性，因为胚胎十分脆弱，容易被损坏或受到粗暴操作。为避免这种情况，必须缓慢、谨慎地移动针头，并以微小的幅度进行推进。最佳的学习方法是通过练习，以准确掌握胚胎所能承受的触碰力度和压力。在观察时，将持针器中的针和舌片反向安装，使钝端伸出。在显微镜下，使用针头在每个胚胎附近的琼脂中刺出垂直小孔，以便在刺孔的同时可在显微镜下观察。持针时通常有一定角度，因此很难刺出完全垂直的小孔。然而，针头的轻微倾斜会在孔的一侧形成微小的凹陷或沟槽，从而使胚胎易于沿此沟槽滑入孔中。接下来，确定细长胚胎的前端和后端，因为胚胎应以一致的方向推入孔中。通常将前端朝上，前端的卵膜具有一个特化的结构。使用针的钝端，推动胚胎使其在琼脂上移动，并调整其后端朝向一个穿刺好的孔洞。然后将胚胎前端推向小孔。胚胎应顺着穿刺时形成的小凹陷轻松滑入孔中。当胚胎向上倾斜时，将其进一步推入孔内。琼脂足够柔软，一旦将胚胎部分插入戳出的小孔中，便可进一步推入而不会造成损伤。当胚胎完全推入后，通常已基本呈垂直状态。若未达到垂直，则需从侧面轻轻推动，使插入的胚胎更接近垂直方向。如果孔洞不是太大，琼脂在整个离心过程中能够稳定地固定胚胎位置。经过练习，每块培养板可包埋100至250个胚胎。所需胚胎数量取决于后续应用。尽量缩短封片时间。如果需要特定的发育阶段，由于胚胎在封片过程中仍会继续发育，应使用湿润的毛笔移除未使用的多余胚胎。接着，将置于琼脂中的胚胎进行离心处理。将盛有果蝇胚胎的培养皿转移至离心机的摆桶中，琼脂面朝下放置。确保离心机已均匀配平，并在4至10摄氏度条件下以每分钟4,000转的速度离心30分钟。离心结束后，将琼脂平板置于解剖显微镜下，用针的钝端覆盖一层TSS。将胚胎从孔洞中取出。胚胎会漂浮在TSS中但保持浸没状态。胚胎结构层次分明，前端呈棕色帽状，中间区域透明，后端为深灰色区域。弃去在明场或落射荧光显微镜下无法显示清晰分层的胚胎。使用 P200 移液器将分层良好的胚胎从 TSS 转移至微量离心管中。然后将缓冲液中的胚胎转移至玻璃载玻片，按照随附书面实验方案中所述进行封片。如果需要固定胚胎，使用 P 200 移液器将分层良好的胚胎转移至 TSS 中的闪烁瓶内。采用标准固定技术固定胚胎。因为离心胚胎时，灭活步骤的效率较低。尽可能使用较多的胚胎。如果胚胎将用于移植实验，则将胚胎转移至琼脂平板，并在盖玻片上进行固定。采用标准的胚胎操作流程，相关操作步骤可参见书面实验方案。离心诱导的分层可稳定维持数十分钟。以下是离心前活体 oph 胚胎的明场图像，显示时以左侧为前端，右侧为后端，背侧向上，腹侧向下。卵裂期胚胎呈现均匀外观。像这样的褐色阶段非常适合体内离心。Blaster derm 胚胎具有清晰的边缘，各侧外观相似。这一清晰的周边区域会不断扩展，直至原肠化末期。胚胎在发生结束前仍可通过离心法成功进行分层。此时卵黄与细胞核的分层不如卵裂期一致。细胞化胚胎出现后，其形态变得不对称，背侧与腹侧逐渐分明，并形成多种褶皱结构。图中所示胚胎处于原肠带早期延伸阶段。在此阶段，离心已无法有效分离主要细胞器。胚胎发育是一个连续过程。因此，这些阶段并非相互独立的实体，而是随着发育的进行相互转化。这段延时影像记录了从卵裂阶段开始的四小时胚胎发生过程，其中胚带伸长效应被加速了720倍。以下是使用透射照明拍摄的离心后胚胎图像。左侧的胚胎分层良好，低密度的脂滴在胚胎最前端形成脂帽。高密度的卵黄颗粒在后端聚集形成深灰色区域。这两层结构之间由一个较宽的透明区域分隔，代表其他细胞器和细胞质。右侧的胚胎在受精后进行了离心处理。如果有落射荧光显微镜，分层现象将极不明显。这些活的经离心处理的胚胎可在紫外光激发下进行观察，其中卵黄会显示出强烈的蓝色水荧光。在胚胎后极出现一层致密的自发荧光物质，表明离心成功，并可作为后端的标记。如果对胚胎进行固定，各层的外观将发生显著变化。脂滴会变得半透明，脂质层在明场显微镜下呈现灰白色、絮状，而非深棕色。固定还会部分或完全破坏卵黄囊荧光，使其强度显著减弱，甚至无法检测。在此图像中，细胞器通过荧光标记物进行标记，这些标记物沿前后轴呈现出特征性的分布位置。某些组蛋白融合蛋白可同时定位于脂滴和细胞核中，因此不仅可用于标记这些细胞区室，还可通过标记的细胞核数量来监测胚胎的发育阶段。正如您刚才所见，该实验操作中最具有挑战性的环节之一是将胚胎包埋至螺旋推进器中。但经过一些练习后，您将能够快速高效地完成这一操作。一旦掌握，该技术可使原本繁琐的共定位实验变得非常简单。例如，我们实验室通常使用该技术通过荧光显微镜检测目的蛋白是否定位于特定的主要细胞器。此外，可从离心后的胚胎中回收各个分层，用于生化分析或移植实验。该技术不仅适用于果蝇胚胎。离心法还可根据密度分离其他物种的卵细胞以及其他大型细胞类型（如细胞）中的细胞器。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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一种用于从 Drosophila 胚胎中分离蛋白质复合物的 in vivo 交联方法

本实验方案的目的是提供一种简单且低成本的方法，用于中等规模（0.5–1...

中等规模制备 果蝇 用于蛋白质组学实验的胚胎提取物

本研究描述了一种生成高分辨率图像的实验方案 原位 紧密分期的原肠胚形成前Hi-C文库 黑腹果蝇...

从精确分期的早期Drosophila胚胎中构建全基因组染色质构象捕获文库

本文介绍了一种利用基于平板的高内涵成像系统，对多个果蝇（Drosophila）胚胎在胚胎发育过程中进行显微注射并同时成像的实验方案。...

利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

本文提供了一种用于活体成像晚期胚胎期黑腹果蝇（Drosophila）雄性生殖腺的解剖方案。该方案可用于在正常条件下，或经过转基因操作及药物干预后，观察细胞内的动态过程。...

晚期胚胎的解剖与活体成像 果蝇 性腺

本文介绍了一种在早期Drosophila胚胎中实施膨胀显微技术的实验方案，旨在利用常规激光扫描共聚焦显微镜实现超分辨率成像。...

使用扩展显微镜技术对整体安装的 Drosophila 胚胎进行物理放大以实现超分辨率成像

Drosophila 转基因的胚胎显微注射

学习利用体内离心技术在活果蝇胚胎中按密度分离细胞器的方法。该技术可避免体外分离造成的假象，便于进行共定位实验和生化分析，为细胞生物学研究提供可靠手段。

体内离心果蝇胚胎

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体内 离心 果蝇 胚胎

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