驱动蛋白动力分子穿梭车的货物装载

本实验的总体目标是将纳米球加载到在覆盖有驱动蛋白马达的表面上滑行的微管上。首先，用酪蛋白溶液包被玻璃流动池的表面。实验的第二步是将驱动蛋白马达蛋白吸附到流动池表面。

该实验步骤的第三步是加入微管。最后一步是加入链霉亲和素分子，这些分子将与微管结合，然后加入纳米微球。纳米微球会结合到流动池表面，随后可被微管捕获。

最终，可以通过荧光显微镜观察到纳米球如何被微管捕获并沿表面进行运输。大家好，我是来自佛罗里达大学亨利·赫斯博士实验室及材料科学与工程系的Elaine Jen Smith。今天我们将向您展示一种倒置运动性测定实验的操作流程。

我们在实验室中采用此方法研究货物在微管上的装载以及分子穿梭的运动。现在让我们开始。在开始此操作之前，按照本视频文字部分所述，新鲜配制所有储备溶液。

配制好母液后，开始进行微管制备：将25微升生长溶液加入0.65毫升的微量离心管中。然后将6.25微升生长溶液加入20微克冻干的生物素化微管蛋白中。涡旋混匀溶液，并将其置于37摄氏度水浴中孵育30分钟以促进聚合。孵育结束后，用紫杉醇缓冲液将溶液稀释100倍，并轻轻涡旋混匀。

该溶液用于稳定微管。将此溶液标记为“empty 100”，并在室温下保存。接着，用抗淬灭缓冲液将 MT 100 进行十倍稀释，并将该溶液标记为 MT 1000。

然后通过将驱动蛋白溶液在TP缓冲液中稀释20倍来制备驱动蛋白马达。将该溶液标记为kinase in 20，并置于冰上保存。最后，配制链霉亲和素和纳米球溶液。

首先，将 Alexa Fluor 568 标记的链霉亲和素加入到抗生物素缓冲液中，使其终浓度为 100 纳摩尔。将该溶液标记为 STV 100；然后将纳米球在抗生物素缓冲液中稀释 5,000 倍，并将此混合液标记为 NS 5,000。将这两种溶液均置于冰上保存。

在完成货物装载实验的溶液配制后，使用载玻片和由双面胶带隔开的盖玻片构建一个流动池。首先，在载玻片边缘粘贴两条双面胶带，两条胶带之间留出约一厘米的间隙。然后将盖玻片覆盖在胶带上。

使用镊子的平坦边缘对盖玻片施加压力以形成密封。构建的流动池长约2厘米，宽约1厘米，高约100微米，体积约为20微升。开始倒置实验装置的组装。

将移液器的吸头置于盖玻片与载玻片之间，然后向流动池中注入浓度为 0.5 毫克/毫升的酪蛋白溶液。该涂层可使驱动蛋白在吸附后保持其功能活性。

等待五分钟，使酪蛋白溶液充分包被。接着，通过移液器将激酶溶液引入流动池，使驱动蛋白吸附到流动池表面。将移液器尖端置于盖玻片与载玻片之间，将溶液从一侧注入流动池，同时用吸水纸从另一侧吸引，使溶液流过整个流动池。

用滤纸，使激酶吸收5分钟。接着，通过移液将MT 1000溶液加入流动池中，使微管进入流动池。待微管附着于激酶分子马达后，静置5分钟，使微管沉降并牢固结合于激酶分子马达上。

通过将 STV 100 溶液引入流动池，用荧光标记的链霉亲和素 TTR 包被微管。孵育五分钟，使链霉亲和素 TTR 分子与微管结合。随后向流动池中加入三次 30 微升的 Antifa 溶液，洗涤去除未结合的链霉亲和素 TTR。

最后，通过移液将NS 5,000溶液中的生物素化聚苯乙烯荧光素纳米球引入流动池。纳米球被表面固定吸附。这些纳米球将与运动的微管碰撞并结合到微管上。

本实验使用配备100倍油镜、X位点、一个20瓦灯和Exon E-M-C-C-D相机的Eclipse TE 2000 U荧光显微镜。首先，在物镜上滴加一滴浸油，然后使用三轴滤光立方体将流动池固定在显微镜载物台上。

将微管调至焦点，然后切换到Fitzy滤光片组以观察纳米球。接着，打开and or I exon程序并将采集模式设置为动力学模式。使用0.5秒的曝光时间，动力学序列长度为20，动力学循环时间为6秒。

将显微镜从目镜切换至相机，并开始采集图像。前四幅图像使用trixi滤光立方体对微管进行成像；接下来的12幅图像，切换至Fitz滤光立方体以采集纳米微球的图像。

然后切换回 trixi 滤光立方体。最后四幅图像用于观察微管，使用 Trissy 滤光立方体观察微管，并将滤光立方体切换至 fite 以在此处可视化纳米球，由箭头标示出由微管运输的纳米球。并非所有纳米球均被微管捕获。

36秒后显示纳米球的位置，可以看出纳米球已经发生移动。再次成像微管时，明显可见微管也在视野中发生了位移。这些图像表明，纳米游戏副本是由于微管的穿梭运动而被移位的。

我们刚刚向您展示了如何进行倒置运动性分析。在执行此操作时，重要的是在采集图像时记得切换滤光片组，以便能够同时观察到微管和纳米微球。就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。