驱动蛋白动力分子穿梭车的货物装载

本实验的总体目标是将纳米球装载到在激酶马达蛋白包被的表面上滑行的微管上。首先，用酪蛋白溶液包被玻璃流动池的表面；其次，将驱动蛋白马达蛋白吸附到流动池表面。

该实验步骤的第三步是加入微管。最后一步是加入链霉亲和素分子，这些分子将与微管结合，然后加入纳米微球。纳米微球会结合到流动池表面，随后可被微管捕获。

最终，可以通过荧光显微镜观察到纳米球如何被微管捕获并沿表面进行运输。大家好，我是来自佛罗里达大学材料科学与工程系Henry Hess博士实验室的Elaine Jen Smith。今天我们将向您展示一种倒置运动性测定实验的操作流程。

我们在实验室中采用此方法研究货物在微管上的装载以及分子穿梭的运动。现在让我们开始。在开始此操作之前，按照本视频文字部分所述，新鲜配制所有储备溶液。

配制好储备液后，开始进行微管制备：将25微升生长溶液加入0.65毫升的微量离心管中。然后将6.25微升生长溶液加入20微克冻干的生物素化微管蛋白中。涡旋混匀溶液，并将其置于37摄氏度水浴中孵育30分钟以促进聚合。孵育结束后，用紫杉醇缓冲液将溶液稀释100倍，并轻轻涡旋混匀。

该溶液用于稳定微管。将此溶液标记为 empty 100，并在室温下保存。接着，用抗淬灭缓冲液将 MT 100 进行十倍稀释，并将此溶液标记为 MT 1000。

然后通过将驱动蛋白溶液在TP缓冲液中稀释20倍来制备驱动蛋白马达。将该溶液标记为kinase in 20，并置于冰上保存。最后，配制链霉亲和素和纳米球溶液。

首先，将 Alexa Fluor 568 标记的链霉亲和素加入抗荧光缓冲液（Antifa Buffer）中，使其浓度达到 100 纳摩尔。将该溶液标记为 STV 100；然后将纳米球在抗荧光缓冲液中稀释 5,000 倍，并将此混合液标记为 NS 5,000。将这两种溶液均置于冰上保存。

在完成货物装载实验的溶液配制后，使用载玻片和由双面胶带隔开的盖玻片构建一个流动池。首先，在载玻片边缘粘贴两条双面胶带，两条胶带之间留出约一厘米的间隙。然后将盖玻片覆盖在胶带上。

使用镊子的平边对盖玻片施加压力，以形成密封。构建的流动池长约2厘米，宽约1厘米，高约100微米，体积约为20微升。开始倒置实验装置的组装。

将移液器吸头置于盖玻片与载玻片之间。然后向流动池中注入 0.5 毫克/毫升的酪蛋白溶液。该涂层可使驱动蛋白在吸附后保持其功能活性。

等待五分钟，使酪蛋白溶液充分包被。接着，通过移液枪将激酶溶液引入流动池中，使其吸附驱动蛋白。加样时，将移液枪尖置于盖玻片与载玻片之间，从一侧注入溶液，同时从另一侧用吸水纸引流，以实现溶液的置换。

用滤纸，使激酶吸收5分钟。接着，通过移液将MT 1000溶液加入流动池中，引入微管。待微管附着于激酶分子马达后，静置5分钟，使微管沉降并结合到激酶分子马达上。

通过将 STV 100 溶液引入流动池，用荧光标记的链霉亲和素 TTR 包被微管。孵育五分钟，使链霉亲和素 TTR 分子与微管结合。随后向流动池中加入三次 30 微升的 Antifa 溶液进行洗涤，以去除未结合的链霉亲和素 TTR。

最后，通过移液将NS 5,000溶液中的生物素化聚苯乙烯荧光素纳米球引入流动池。纳米球被表面固定吸附，将与运动的微管碰撞并结合到微管上。

在本实验中，使用配备有 100 倍油镜、X site、一个 20 灯以及 exon E-M-C-C-D 相机的 Eclipse TE 2000 U 荧光显微镜。首先，在物镜上滴加一滴浸油，然后使用 trixy 滤光立方体将流动池固定在显微镜载物台上。

将微管调至焦点，然后切换到Fitzy滤光立方体以观察纳米球。接着，打开and或I外显子程序，将采集模式设置为动力学模式。使用0.5秒的曝光时间，动力学序列长度为20，动力学循环时间为6秒。

将显微镜从目镜切换至相机，并开始采集图像。前四幅图像使用trixi滤光立方体对微管进行成像；接下来的12幅图像，切换至Fitz滤光立方体以采集纳米微球的图像。

然后切换回三色滤光片。为了最后四幅微管成像图像，使用Trissy滤光片观察微管，并将滤光片切换至fite以在此处可视化纳米球；由箭头标示出由微管运输的纳米球。并非所有纳米球均被微管捕获。

36秒后再次显示纳米球的位置，可以看出纳米球已经发生位移。当再次对微管进行成像时，可以明显观察到微管也已跨越视野移动。这些图像表明，纳米球的位移是由于微管的穿梭运动所致。

我们刚刚向您展示了如何进行倒置运动性分析。在执行此操作时，重要的是在采集图像时记得切换滤光片组，以便能够同时观察到微管和纳米微球。就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。