从细胞系生成球状体:一种三维 （3D） 细胞培养方法

将所需细胞系培养为贴壁 2D 单层。去除培养基并用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤。然后，加入胰蛋白酶并孵育，同时细胞从培养瓶表面分离并变成圆形。添加新鲜培养基以中和胰蛋白酶并悬浮细胞。将混合物转移到锥形管中，并使用离心机沉淀细胞。

用新鲜培养基替换上清液并重悬细胞沉淀。使用血细胞计数器计数细胞数并计算工作浓度。然后，将适量的细胞混合物转移到圆底超低粘附孔板中并孵育。细胞沉降到底部并聚集。它们最终将相互连接并形成一个紧凑的 3D 细胞组件，即球状体。

在示例方案中，我们将了解如何从结肠癌细胞系生成 3D 球状体，以及如何应用实时成像来跟踪它们的形成。首先用 5 ml PBS 洗涤目标结直肠癌细胞系，然后用 0.5 ml 胰蛋白酶在 37 摄氏度下去除细胞 5 分钟。在显微镜下确认分离后，用 10 毫升完全培养基中和细胞解离酶，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于 5 mL 新鲜完全培养基中进行计数，并以每毫升浓度的 1.5 乘以 10 至第三个细胞的浓度重悬细胞。

然后将 20 微升细胞接种到 96 孔圆底板的每个孔中，并将板放入 37 摄氏度培养箱内的自动成像装置中，培养箱含 5% CO2 和 95% 湿度。登录设备的采集软件，然后选择 Schedule to Acquire、Launch Add Vessel、Scan on Schedule 和 Create Vessel、New。接下来，选择扫描类型、球状体，并选择适当的目标明场和荧光通道。将放大倍数设置为 10 倍，然后选择板型号及其在成像仪抽屉中的位置。选择要成像的孔的位置，并输入实验描述，包括名称、细胞类型和细胞数量。

对于分析设置，选择将分析推迟到以后，右键单击时间轴，然后选择设置选定的扫描组间隔，然后将添加扫描间隔设置为四小时，将总共添加为 24 小时。然后将开始时间设置为在自动成像仪中孵育后至少一小时。要检查球体生长进度，请每两天登录一次成像软件，然后选择 View Recent Scans（查看最近的扫描）。双击感兴趣的实验，然后在 Image Channels 面板中选择 Brightfield。然后使用测量图像要素工具测量椭球体的直径。第 4 天每孔添加 50 μL 完全培养基，以限制任何显影效应培养基。