利用微阵列技术对tRNA的氨酰化（荷载）水平进行全基因组分析

以下实验的总体目标是确定tRNA荷载水平的相对变化。首先，在处理前后于低pH条件下分离RNA，以获得保持完整荷载状态的tRNA。第二步，对RNA进行高碘酸氧化处理，从而实现对tRNA相对荷载水平的测定。

接下来将样品与荧光标记的寡核苷酸连接，并在微阵列上进行杂交，以检测因A-T-R-N-A充电引起的连接水平变化，并获得结果。该方法基于tRNA微阵列技术，用于检测CHO基因组中tRNA充电水平的变化。大家好，我是约翰·宰（John Zai），来自芝加哥大学生物化学与分子生物学系DRT Pan实验室。

今天我将向您展示一种在基因组水平上分离和测定带电tRNA的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法来检测应激条件下tRNA荷载的变化。现在让我们开始吧。

为了分离tRNA的总电荷，首先培养相当于30 OD 600的酵母细胞，应获得30微克总RNA。在台式离心机中沉淀细胞，用裂解缓冲液重悬细胞。加入等体积的乙酸钠、饱和苯酚-氯仿，涡旋振荡30秒，随后冰浴至少30秒。

重复涡旋和切碎操作再进行两次。在4°C条件下，以18,600 ×g离心15分钟。然后移除水相，并在第二次提取后再次进行乙酸饱和的苯酚-氯仿抽提。

加入2.7倍体积的乙醇沉淀RNA，并在4°C下以18,600 ×g离心30分钟。将RNA沉淀重悬于裂解缓冲液中，再用乙醇进行第二次沉淀。最后，将RNA重悬于含有10毫摩尔/升醋酸缓冲液和1毫摩尔/升EDTA的溶液中，用于后续处理。

样品可在零下80摄氏度稳定保存约两周以上。不建议长期储存，因为部分带电荷的TNA在使用S3或SCI五种荧光寡核苷酸标签标记前会开始发生去氨酰化。总tRNA需进行对苯二甲醛氧化处理，该处理允许测定相对氨酰化水平；将总RNA与每种eco irna标准品（终浓度0.066微摩尔）以及100毫摩尔醋酸缓冲液混合，并加入50毫摩尔对苯二亚甲基二钠（sodium par IID date）；对于不进行氧化处理的对照tRNA样品，则用50毫摩尔氯化钠替代对苯二亚甲基二钠。

室温孵育反应30分钟。30分钟后，加入葡萄糖至终浓度为100毫摩尔，并在室温下继续孵育5分钟以终止反应。反应终止后，使用G-25离心柱进行缓冲液置换，以去除样品中残留的丙酸钠。通过加入醋酸盐缓冲液使氯化钠终浓度达到133毫摩尔，终浓度达到66毫摩尔，并加入2.7倍体积的乙醇，沉淀样品。

接下来，通过Resus分离tRNA样品，将其悬浮于50毫摩尔/升的Tris-HCl中，在37摄氏度孵育30分钟。30分钟后，加入等体积的50毫摩尔/升醋酸缓冲液和100毫摩尔/升氯化钠，并加入2.7倍体积的乙醇进行沉淀，以中和反应。将RNA沉淀重新悬浮于水中，浓度约为1微克/微升。

在通过琼脂糖凝胶电泳检测对照样品和氧化样品的RNA质量后，可进行荧光标记，将荧光寡核苷酸标签连接到tRNA上。将0.1微克/微升的去磷酸化RNA与4微摩尔的SI-3或SI-5寡核苷酸、连接酶缓冲液、15% DMSO以及0.5单位/微升的T4 DNA连接酶和酵母碱性磷酸酶混合，于16摄氏度孵育超过16小时。连接反应完成后，将样品与四倍体积的乙酸钾和氯化钾混合，随后用等体积的苯酚-氯仿抽提。抽提后，用乙醇沉淀水相中的RNA。最后，在杂交前将RNA沉淀重悬于水中，浓度约为0.1微克/微升，并将微阵列芯片、矿物油和蒸馏水孵育1至2分钟，以去除未结合的寡核苷酸。

接下来，将 S3 或 SCI 五标记样品与 140 微升杂交缓冲液中的鲑鱼精子 DNA 混合，使终浓度为 140 微克/毫升，并加入 poly A 使其终浓度为 7 µg/毫升，在自动芯片杂交仪上运行杂交程序。我们强烈建议在 tRNA 实验中使用自动杂交仪，因为手动杂交会导致较高的背景信号。杂交程序完成后，将芯片在 50 毫升锥形管中用洗涤液 3 轻轻振荡洗涤 3 至 5 分钟。

将载玻片在预先用铝箔包裹的离心管中至少洗涤两次。以低速离心5至10分钟使载玻片干燥，以获得最佳效果。载玻片干燥后应立即进行扫描。

载玻片可扫描两到三次，而图像质量不会出现明显下降。此处展示的是一个正确分离的总RNA样本及其分析结果的代表性数据。该样本具有非常干净的光谱，其OD260与OD280比值接近2，在1%琼脂糖凝胶电泳中未检测到蛋白质或苯酚污染。氧化处理组和对照组样本均应显示出清晰的rRNA条带，其他可能的核酸条带则因生物种类不同而有所差异。

如果某个样品明显弱于其他样品，或出现拖尾现象，则不应将其用于微阵列实验。微阵列的背景信号应非常低，其强度需比最弱的tRNA探针低一个数量级。以上我已向您演示了在进行该实验时，如何分离tRNA并测定其相对氨酰化水平。

务必记住在氧化和扩增步骤中保持试剂无核酸酶污染。感谢观看，祝您的实验顺利成功。