Name: （充电）酰化tRNA的使用微阵列技术水平的全基因组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习使用微阵列技术在全基因组水平分析酿酒酵母tRNA氨酰化水平的方法。该方法通过高碘酸氧化处理和荧光标记，实现高通量检测tRNA充电水平变化，为研究细胞应激反应中的蛋白质合成效率提供可靠工具。

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Pan实验室的酵母研究工作由日本味之素公司（Ajinomoto, Inc. Japan）以及美国国立卫生研究院培训基金T32GM007183-33资助。我们感谢印第安纳大学医学院的Ronald Wek博士长期以来在酵母项目上的合作，同时也感谢Kimberly Dittmar博士开发了tRNA荷载微阵列方法。

第1部分：总带电tRNA的分离
<ol>
<li>在台式离心机中以 2000 RFC 离心 5 分钟收集细胞。相当于 1 OD600 的细胞应至少产生 1 μg 总 RNA，建议本实验使用不少于 30 μg 的 RNA。</li>
<li>用裂解缓冲液重悬细胞，裂解缓冲液由 0.3 M 缓冲 Na+-乙酸盐（pH 4.5）和 10 mM EDTA 组成。加入等体积的 Na+-乙酸盐饱和酚/氯仿（pH 4.5），涡旋振荡 3 次，每次 30 秒。每次涡旋后务必立即将样品置于冰上。缓冲乙酸盐可用 NaOAC 和 HOAc 配制，乙酸盐饱和酚/氯仿可通过将 1 份 5 M 缓冲乙酸盐（pH 4.5）与 9 份酚/氯仿混合制备。 
 注意：总 RNA 的分离需在弱酸性条件和冰上进行，以避免荷载 tRNA 的脱酰基化。</li>
<li>在 4°C 下以 18,600 RFC 离心 15 分钟，收集水相，并再次进行乙酸盐饱和酚/氯仿抽提。</li>
<li>第二次抽提后，加入 2.7 倍体积的乙醇沉淀 RNA，并在 4°C 下以 18,600 RFC 离心 30 分钟。</li>
<li>将 RNA 沉淀重悬于裂解缓冲液中，再用乙醇进行第二次沉淀。</li>
<li>最后，将 RNA 重悬于含 10 mM 缓冲乙酸盐（pH 4.5）和 1 mM EDTA 的溶液中，用于后续处理。样品可在 -80°C 稳定保存约两周。不建议更长时间保存，因为部分荷载 tRNA 会开始发生脱酰基化。</li>
</ol>
第二部分：tRNA 标准品的制备
<ol>
 <li>将浓度为 10.5 μM 的 E. coli tRNA 标准品在 45 mM Tris-Cl（pH 7.5）中于 85°C 加热 2 分钟。取出离心管，室温下静置 3 分钟。</li>
 <li>加入 MgCl2 至终浓度为 20 mM，并在 37°C 下孵育 5 分钟。</li>
 <li>加入氨酰-tRNA 合成酶反应混合液，使最终反应体系包含 5 μM tRNA、60 mM Tris-HCl（pH 7.5）、12.5 mM MgCl2、10 mM KCl、3 mM 二硫苏糖醇、1.5 mM ATP、1 mM 精胺、1 mM 对应氨基酸以及 4.2 单位/μl 的 E. coli 氨酰-tRNA 合成酶混合物。在 37°C 下孵育 15 分钟。</li>
 <li>加入等体积的 0.5 M 缓冲乙酸盐（pH 4.5），并在 pH 4.5 条件下用乙酸盐饱和的苯酚/CHCl3 进行抽提。</li>
 <li>用 2.7 倍体积的乙醇沉淀 tRNA 标准品，并在 4°C 下以 18,600 ×g 离心 30 分钟。</li>
 <li>将标准品重悬于含 1 mM EDTA 的 50 mM 缓冲乙酸盐（pH 4.5）中，于 −80°C 保存，可稳定保存一个月。</li>
</ol>
第3部分：tRNA的Cy3/Cy5标记
<ol>
 <li>对于带电tRNA样品，将总RNA在0.1浓度下孵育 &mu;克/&mu;l 与 0.066 &mu;M 每个 E. coli tRNA 标准品（即每种标准品 0.67 pmol 每个） &mu;g 总 RNA）和 100 mM 乙酸盐缓冲液（pH 4.5），在 50 mM NaIO₄ 存在下室温孵育 30 分钟。对照组总 tRNA 样品则用 50 mM NaCl 替代 NaIO₄。请注意仅使用缓冲溶液稀释 RNA，以保持其荷载状态。 </li>
 <li>加入葡萄糖至终浓度为100 mM以终止反应，并在室温下孵育5分钟。</li>
 <li>为了去除样品中残留的 NaIO4，使用 G25 离心柱进行缓冲液置换。为获得最佳效果，在上样前先用 200 mM 乙酸盐缓冲液（pH 4.5）平衡柱子。</li>
 <li>通过加入缓冲乙酸盐（pH 4.5）至终浓度133 mM、NaCl至终浓度66 mM以及2.7倍体积的乙醇，使样品沉淀。氧化样品有时可能需要进行第二次沉淀。仅当样品沉淀物与同一样品的对照沉淀物在形态上存在明显差异时（例如沉淀物显著更大或更弥散），才需进行第二次沉淀。若需进行第二次乙醇沉淀，应先将沉淀物重悬于50 mM乙酸盐缓冲液（pH 4.5）和200 mM NaCl中，再加入乙醇。 </li>
 <li>对于去酰化，将tRNA样品重悬于50 mM Tris-HCl（pH 9）中，并在37℃下孵育 &deg;C 反应 30 分钟。加入等体积的 50 mM 缓冲醋酸盐（pH 4.5）和 100 mM NaCl 中和反应。用 2.7 倍体积的乙醇沉淀。沉淀后，RNA 重悬于水中，浓度约为 1 &mu;克/&mu;l. 应将对照样品和氧化处理样品均在琼脂糖凝胶上电泳，以检测RNA质量。</li>
 <li>将荧光寡核苷酸标签连接到 tRNA 0.1 &mu;克/&mu;l 脱乙酰化 RNA 在 1x 连接酶缓冲液、15% DMSO、4 &mu;含 Cy3 或 Cy5 的寡核苷酸，0.5 单位/&mu;l T4 DNA连接酶和酵母外切磷酸酶（5,000单位/&mu;l) 在 16&deg;C 过夜（超过16小时）。外切磷酸酶仅对从酵母获得的样品是必需的，如果本方案用于其他样品，则可省略该步骤。 E. coli 或人源样本。 </li>
 <li>连接反应完成后，将样品与4倍体积的50 mM KOAc（pH 7）、200 mM KCl混合，再用等体积的苯酚/氯仿抽提。抽提后取水相，用乙醇沉淀RNA，然后溶于水，浓度约为0.1 &mu;克/&mu;l.</li>
 <li>连接效率可通过将5-10%的样品在含7 M尿素的12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并使用荧光凝胶扫描仪进行可视化来评估。该PAGE分析还有助于确定微阵列杂交所需的氧化样品和对照样品的用量。理想的连接结果应显示约10%或更多的含Cy3/Cy5的寡核苷酸成功连接至tRNA。对于标记效率良好的样品，0.1–0.5 &mu;每份样品使用 g 总 RNA 进行芯片杂交。</li>
</ol>
第4部分：微阵列的杂交与分析
<ol>
 <li>杂交前，将微阵列芯片在蒸馏水中煮沸1-2分钟，以去除未结合的寡核苷酸。</li>
 <li>将Cy3/Cy5标记的样品与140 μl杂交缓冲液、鲑鱼精子DNA（终浓度为140 μg/ml）以及poly(A)（终浓度为70 μg/ml）混合。</li>
 <li>在自动芯片杂交仪上运行杂交程序（表1）。对于tRNA实验，强烈建议使用自动杂交设备，因为手工杂交会导致较高的背景信号。</li>
 <li>程序结束后，将芯片置于50 ml锥形管中，用Wash 3溶液轻轻振荡洗涤至少两次，每次3-5分钟。</li>
 <li>可通过低速离心（转速低于200 RFC）5-10分钟干燥芯片。必须避免光照，因为暴露于光下会导致荧光染料漂白。</li>
 <li>芯片干燥后应立即扫描以获得最佳结果；如有必要，可在室温下干燥避光环境中保存数天。芯片可重复扫描2-3次，图像质量无明显下降。</li>
</ol>
第5部分：代表性结果
若分离操作得当，总RNA样品应产生非常清晰的光谱，其OD260:OD280比值接近2。样品中应无蛋白质或苯酚污染的可检测信号。在1%琼脂糖凝胶电泳中，应观察到明显的tRNA条带，其他核酸条带则因生物种类不同而有所差异。氧化后应观察到清晰的tRNA条带。若某样品信号明显弱于其他样品，或出现拖尾现象，则不应将其用于微阵列实验。微阵列的背景信号应非常低，通常比最弱的tRNA探针信号低一个数量级。高背景信号通常源于洗涤步骤中的问题，一般可通过配制新鲜的洗涤液，并彻底清洗所有设备和管路以去除残留及析出的SDS来解决。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>步骤</td>
 <td>细节</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>O形圈预处理</td>
 <td>75°C，2 分钟</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>加入样本</td>
 <td>60°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>样本变性</td>
 <td>90°C，5 分钟</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>杂交</td>
 <td>60°C，16 小时</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>洗涤 1</td>
 <td>50°C，流动 10 秒，暂停 20 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>洗涤 2</td>
 <td>42°C，流动 10 秒，暂停 20 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>洗涤 3</td>
 <td>42°C，流动 10 秒，暂停 20 秒</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1：杂交实验步骤

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们介绍一种可在基因组尺度上同时测定所有tRNA相对荷载水平的方法。本文所述方案已针对S. cerevisiae进行优化，并已成功用于测定E. coli和人源细胞培养物中的tRNA荷载谱型。只要能够获得完整的荷载tRNA，该方法可经修改后适用于任何具有已知基因组序列的生物体（以便注释全部tRNA基因）。

<table><tbody><tr><td>Microspin G-25 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 氨酰-tRNA 合成酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Hyb4 杂交站</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B 扫描仪</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用微阵列技术对trna的氨酰化（荷载）水平进行全基因组分析

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA 氨酰化（或称充电）水平会随着环境变化在细胞内迅速改变[1]。原核和真核细胞中 tRNA 充电水平的变化可导致翻译调控，这是细胞应激反应的重要机制之一。常见的例子包括原核生物中的严谨反应E. coli以及酵母中的Gcn2应激反应通路（[2-6]）。近期的研究工作在E. coli和S. cerevisiae已表明，tRNA 荷载模式具有高度动态性，并取决于细胞所经历的应激类型 [1, 6, 7]。tRNA 荷载的高度动态性和可变性使得在基因组尺度上测定 tRNA 荷载水平的变化至关重要，以全面阐明细胞对环境变化的响应。在本综述中，我们介绍了一种同时测定所有 tRNA 相对荷载水平的方法S. cerevisiae . 尽管本文所述方案针对酵母，但该方案已成功应用于多种生物体中相对氨酰化水平的测定，包括E. coli以及人类细胞培养[7, 8]。

我们描述了一种微阵列分析方法，用于测定酿酒酵母（S. cerevisiae）中所有tRNA的相对氨酰化水平。

利用微阵列技术对tRNA的氨酰化（荷载）水平进行全基因组分析

tRNA 氨酰化（或称荷载）水平可随环境变化在细胞内迅速发生改变[1]。tRNA 荷载水平的变化在……中均具有重要作用

以下实验的总体目标是确定tRNA荷载水平的相对变化。首先，在处理前后于低pH条件下分离RNA，以获得保持完整荷载状态的tRNA。第二步，对RNA进行高碘酸氧化处理，从而实现对tRNA相对荷载水平的测定。接下来将样品与荧光标记的寡核苷酸连接，并在微阵列上进行杂交，以检测因A-T-R-N-A充电引起的连接水平变化，并获得结果。该方法基于tRNA微阵列技术，用于检测CHO基因组中tRNA充电水平的变化。大家好，我是约翰·宰（John Zai），来自芝加哥大学生物化学与分子生物学系DRT Pan实验室。今天我将向您展示一种在基因组水平上分离和测定带电tRNA的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法来检测应激条件下tRNA荷载的变化。现在让我们开始吧。为了分离tRNA的总电荷，首先培养相当于30 OD 600的酵母细胞，应获得30微克总RNA。在台式离心机中沉淀细胞，用裂解缓冲液重悬细胞。加入等体积的乙酸钠、饱和苯酚-氯仿，涡旋振荡30秒，随后冰浴至少30秒。重复涡旋和切碎操作再进行两次。在4°C条件下，以18,600 ×g离心15分钟。然后移除水相，并在第二次提取后再次进行乙酸饱和的苯酚-氯仿抽提。加入2.7倍体积的乙醇沉淀RNA，并在4°C下以18,600 ×g离心30分钟。将RNA沉淀重悬于裂解缓冲液中，再用乙醇进行第二次沉淀。最后，将RNA重悬于含有10毫摩尔/升醋酸缓冲液和1毫摩尔/升EDTA的溶液中，用于后续处理。样品可在零下80摄氏度稳定保存约两周以上。不建议长期储存，因为部分带电荷的TNA在使用S3或SCI五种荧光寡核苷酸标签标记前会开始发生去氨酰化。总tRNA需进行对苯二甲醛氧化处理，该处理允许测定相对氨酰化水平；将总RNA与每种eco irna标准品（终浓度0.066微摩尔）以及100毫摩尔醋酸缓冲液混合，并加入50毫摩尔对苯二亚甲基二钠（sodium par IID date）；对于不进行氧化处理的对照tRNA样品，则用50毫摩尔氯化钠替代对苯二亚甲基二钠。室温孵育反应30分钟。30分钟后，加入葡萄糖至终浓度为100毫摩尔，并在室温下继续孵育5分钟以终止反应。反应终止后，使用G-25离心柱进行缓冲液置换，以去除样品中残留的丙酸钠。通过加入醋酸盐缓冲液使氯化钠终浓度达到133毫摩尔，终浓度达到66毫摩尔，并加入2.7倍体积的乙醇，沉淀样品。接下来，通过Resus分离tRNA样品，将其悬浮于50毫摩尔/升的Tris-HCl中，在37摄氏度孵育30分钟。30分钟后，加入等体积的50毫摩尔/升醋酸缓冲液和100毫摩尔/升氯化钠，并加入2.7倍体积的乙醇进行沉淀，以中和反应。将RNA沉淀重新悬浮于水中，浓度约为1微克/微升。在通过琼脂糖凝胶电泳检测对照样品和氧化样品的RNA质量后，可进行荧光标记，将荧光寡核苷酸标签连接到tRNA上。将0.1微克/微升的去磷酸化RNA与4微摩尔的SI-3或SI-5寡核苷酸、连接酶缓冲液、15% DMSO以及0.5单位/微升的T4 DNA连接酶和酵母碱性磷酸酶混合，于16摄氏度孵育超过16小时。连接反应完成后，将样品与四倍体积的乙酸钾和氯化钾混合，随后用等体积的苯酚-氯仿抽提。抽提后，用乙醇沉淀水相中的RNA。最后，在杂交前将RNA沉淀重悬于水中，浓度约为0.1微克/微升，并将微阵列芯片、矿物油和蒸馏水孵育1至2分钟，以去除未结合的寡核苷酸。接下来，将 S3 或 SCI 五标记样品与 140 微升杂交缓冲液中的鲑鱼精子 DNA 混合，使终浓度为 140 微克/毫升，并加入 poly A 使其终浓度为 7 µg/毫升，在自动芯片杂交仪上运行杂交程序。我们强烈建议在 tRNA 实验中使用自动杂交仪，因为手动杂交会导致较高的背景信号。杂交程序完成后，将芯片在 50 毫升锥形管中用洗涤液 3 轻轻振荡洗涤 3 至 5 分钟。将载玻片在预先用铝箔包裹的离心管中至少洗涤两次。以低速离心5至10分钟使载玻片干燥，以获得最佳效果。载玻片干燥后应立即进行扫描。载玻片可扫描两到三次，而图像质量不会出现明显下降。此处展示的是一个正确分离的总RNA样本及其分析结果的代表性数据。该样本具有非常干净的光谱，其OD260与OD280比值接近2，在1%琼脂糖凝胶电泳中未检测到蛋白质或苯酚污染。氧化处理组和对照组样本均应显示出清晰的rRNA条带，其他可能的核酸条带则因生物种类不同而有所差异。如果某个样品明显弱于其他样品，或出现拖尾现象，则不应将其用于微阵列实验。微阵列的背景信号应非常低，其强度需比最弱的tRNA探针低一个数量级。以上我已向您演示了在进行该实验时，如何分离tRNA并测定其相对氨酰化水平。务必记住在氧化和扩增步骤中保持试剂无核酸酶污染。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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