（充电）酰化tRNA的使用微阵列技术水平的全基因组分析
June 18th, 2010
我们描述了一种用于微阵列分析的方法来确定所有的tRNA相对酰化水平 S。 cerivisiae。
以下实验的总体目标是确定 TRNA 充电水平的相对变化。这是通过在处理前后在低 pH 值下分离 RNA 以分离具有完整电荷水平的 TRNA 来实现的。作为第二步，对 RNA 进行每碘酸盐氧化处理，从而可以确定相对电荷水平。
接下来，将样品连接到荧光寡核苷酸上并在微阵列上杂交，以获得由于 A-T-R-N-A 充电结果引起的连接水平变化。基于 TRNA 微阵列技术的 TRNA 充电的 CHO 基因组水平变化。大家好，我是来自芝加哥大学生物化学和分子生物学系 DRT Pan 实验室的 John Zai。
今天，我将向您展示在基因组水平上分离和测量电荷 TRNA 的程序。我们用它来测量实验室压力源双关语期间 TNA 充电的变化。那么让我们开始吧。
为了分离 TRNA 的总电荷，首先培养至少相当于 30 OD 600 的酵母细胞，这应该会产生 30 μg 的总 RNA 沉淀在台式离心机中的细胞中。将细胞重悬于裂解缓冲液中。加入等体积的乙酸钠、饱和苯基氯仿并涡旋 30 秒，然后冰敷至少 30 秒。
重复涡旋和切块再两次。将样品在 18， 600 RFC 下在 4 摄氏度下离心 15 分钟。然后去除水层，并在第二次提取后进行另一次乙酸盐饱和苯基氯仿提取。
加入 2.7 倍体积的乙醇，并在 4 摄氏度下以 18， 600 RFC 离心 30 分钟，沉淀 RNA。Resus 将 RNA 沉淀悬浮在裂解缓冲液中，然后用乙醇第二次沉淀。最后，将 RNA 重新悬浮在含有 10 毫摩尔缓冲乙酸盐和 1 毫摩尔 EDTA 的溶液中，用于后续处理。
样品可以在零下 80 摄氏度下稳定保存约两周。不建议储存，因为一些带电的 TNA 会在用 S3 或 SCI 5 荧光寡核苷酸标签标记之前开始分离。总 TRNA 经过贱民日氧化处理，这允许测定相对电荷水平，将总 RNA 与 0.066 微摩尔的每种 eco irna 标准品和 100 毫摩尔缓冲乙酸盐混合，在 50 毫摩尔钠 par IID 日期存在下，对于不会被氧化的对照 TRNA 样品，使用 50 毫摩尔氯化钠代替钠 par IID 日期。
30 分钟后，在室温下孵育反应 30 分钟，加入葡萄糖至 100 毫摩尔并在室温下孵育 5 分钟，使反应淬灭。反应淬灭后，使用 G 25 离心柱进行缓冲液置换，以去除样品中残留的按比例酸钠。通过添加终浓度为 133 毫摩尔的缓冲乙酸盐、终浓度为 66 毫摩尔的氯化钠和 2.7 倍体积的乙醇来沉淀样品。
接下来，通过 Resus 分离 tRNA 样品，将它们悬浮在 50 毫摩尔 tris HCL 中，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。30 分钟后，加入等体积的 50 毫摩尔缓冲乙酸盐和 100 毫摩尔氯化钠沉淀物和 2.7 x 体积的乙醇来中和反应。重新将 RNA 沉淀悬浮在水中，浓度约为 1 μg/μL。
通过在琼脂糖凝胶上运行检查对照和氧化样品的 RNA 质量后，我们可以继续进行荧光标记，将荧光寡核苷酸标签贴在 TRNA 上。将每微升 0.1 微克 de RNA 与含有 4 微摩尔 SI 3 或 SI 5 的寡核苷酸连接酶缓冲液 15% DMSO 混合，每微升 T 4 DNA 连接酶和酵母外切磷酸酶，在 16 摄氏度下孵育 16 小时以上 连接后，将样品与四体积的乙酸钾和氯化钾混合， 然后用等体积的苯基氯仿提取，提取水相后，用乙醇沉淀 RNA 制剂。最后，复苏，将 RNA 沉淀悬浮在水中至约 0.1 μg/μL，然后用杂交油、微阵列玻片和蒸馏水 1 至 2 分钟，以去除未结合的寡核苷酸。
接下来，将 S3 或 SCI 5 标记样品与 140 微升杂交缓冲液鲑鱼精子 DNA 混合至终浓度为 140 微克/毫升，poly A 至终浓度为 7 D 微克/毫升，在自动阵列杂交器上运行杂交程序。我们强烈建议使用自动杂交机进行 TRNA 工作，因为手动杂交会产生高背景。杂交程序完成后，在 50 mL 锥形管中轻轻摇动 3 至 5 分钟，用 wash 3 溶液手动洗涤玻片。
在预先用铝箔包裹的试管中洗涤载玻片至少两次。通过低速离心 5 到 10 分钟来干燥玻片，以获得最佳结果。玻片干燥后应立即扫描。
载玻片可以扫描 2 到 3 次，图像质量不会明显下降正确分离的总 RNA 样品及其分析的代表性结果如图所示。该样品具有非常干净的光谱，OD 为 2、60 与 OD 2、80 的比率接近 2，在 1% 农用凝胶上运行时，没有可检测的蛋白质或苯酚污染。氧化样品和对照样品都应显示出较强的 TNA 条带，其他可能的核酸条带因生物体而异。
如果样品明显比其他样品弱，或者观察到拖尾，则不应用于微阵列。微阵列应具有非常低的背景，这比最弱的 TRNA 探针低一个数量级。我刚刚向您展示了在执行此过程时如何隔离和确定 TRNA 的相对充电水平。
请务必记住，请保持试剂不含核酸酶，尤其是在氧化和扩增步骤中。感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本研究提出了一种使用微阵列技术分析酿酒酵母tRNA充电水平的方法。该方法包括分离RNA并测量在各种条件下tRNA充电的变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分子生物学
- 基因组学
背景
- tRNA充电对蛋白质合成至关重要。
- 了解tRNA水平可以提供对细胞应对压力的见解。
- 微阵列技术允许对tRNA群体进行高通量分析。
- 之前的方法在测量相对充电水平方面缺乏效率。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来评估tRNA充电水平。
- 研究压力对酵母tRNA充电的影响。
- 利用微阵列技术进行全面分析。
使用的方法
- 从酵母细胞中分离总tRNA。
- 高碘酸盐氧化处理以评估充电水平。
- 对tRNA进行荧光标记以用于微阵列杂交。
- 分析杂交结果以确定tRNA充电的变化。
主要结果
- 成功分离高质量的tRNA样品。
- 氧化样品和对照样品之间的明显区别。
- 微阵列结果表明tRNA充电水平发生了显著变化。
- 该方法表现出低背景噪音，提高了结果可靠性。
结论
- 开发的方法对于测量tRNA充电水平是有效的。
- 微阵列分析提供了对tRNA动态的宝贵见解。
- 这种方法可用于研究tRNA对各种压力因素的反应。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring tRNA charging levels provides a direct readout of translational capacity and cellular stress response, enabling early detection of pathway dysregulation in disease models. This genomic-scale assay supports target validation by linking amino acid availability to protein synthesis fidelity, a key node in mechanistic de-risking for oncology and metabolic disorder programs. The method’s reproducibility and quantitative output enhance predictive confidence in preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates translational regulation as a functional readout of pathway activity under stress conditions.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of target modulation on global protein synthesis efficiency.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that disrupt tRNA charging homeostasis.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative tRNA charging profiles suitable for high-throughput screening campaigns.
- Reproducibility: Low background noise and stable RNA storage enable consistent data across replicates and sites.
- Scalability: Microarray format allows parallel measurement of all tRNA species, facilitating system-wide translational state assessment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects tRNA charging dynamics to stress response pathways conserved from yeast to human cells.
- Translational Continuity: Enables cross-species comparison of charging patterns in preclinical models.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight into whether observed phenotypes stem from translational dysregulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to assess target impact on translational homeostasis, informing lead optimization before phenotypic screening.
- Discovery Biology: Measures how genetic or pharmacological perturbations affect tRNA charging as a proxy for translational flux.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs that enable comparison of compound effects on charging levels.
- Analytics: Generates normalized charging ratios that support statistical evaluation of condition-dependent changes.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by identifying charging signatures linked to stress response activation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for monitoring translational state across diverse model systems and stress paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking target engagement to translational output.
- Operational Value: Standardized workflow with defined QC steps ensures data integrity across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing off-target effects on protein synthesis machinery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on translational fidelity preservation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, oxidation chemistry, and microarray hybridization.
- Dependent on access to microarray scanners, hybridization ovens, and nuclease-free reagents.
- Necessitates cross-team standardization of RNA isolation and labeling protocols.
- Adaptation to mammalian cells requires validation of oxidation efficiency and labeling kinetics.
- Practical limitation: Method measures relative, not absolute, charging levels and requires careful normalization.
