果蝇挖洞和隧道试验:一种评估果蝇幼虫组织缺氧的方法

- 要设置胚胎收集笼，请使用补充有新鲜酵母糊的葡萄汁琼脂板，并将板放在含有适当基因型的雄性和雌性果蝇的笼子上。酵母和葡萄汁的气味很诱人，可以促进雌性产卵。让产蛋一段时间。然后取出成虫并将胚胎板孵育 24 小时以获得第一龄幼虫。然后轻轻地将一些单独的幼虫从葡萄汁板转移到仅琼脂测试板上，在该测试板上，在板中心的琼脂上切出一个孔并填充酵母糊。

幼虫必须进食才能增加体重才能发育，因此它们在食物来源酵母糊中挖洞。随着它们的发育，幼虫进入游荡阶段并远离食物以寻找化蛹的地点。为了评估缺氧，请检查幼虫在基质中形成的隧道模式。缺乏隧道或隧道不足是缺氧的迹象。在示例协议中，我们将看到如何设置挖洞和隧道测定。

- 按照文本方案中的说明，在产蛋皿中设置对照和实验遗传杂交。在开始定时收集鸡蛋之前，将苍蝇置于黑暗中至少两天。对于定时收集鸡蛋，在当天早些时候将成虫转移到装饰有新鲜酵母酱的新葡萄琼脂盘中，让成虫在盘子上产卵四个小时。四小时后，将成虫转移到新鲜的葡萄琼脂板中。

接下来，将收集板在 25 摄氏度下孵育 4 小时过夜。到第二天下午，大部分幼虫将孵化。计划每个实验组至少有 50 个。

对于单次检测，每个实验组至少准备 5 个检测板。加热，将 16 克果蝇琼脂加入 700 毫升去离子水中。在 95% 乙醇中制备 17.5 毫升 Nipagen。加热琼脂溶液，直到它几乎完全溶解。然后将 Nipagen 溶液加入琼脂溶液中并加热至琼脂完全溶解。短暂冷却琼脂溶液，然后在 10 厘米平板上加载 15 毫升琼脂溶液。琼脂凝胶化后，盖上板盖，让它们在室温下干燥几个小时或过夜。

腌制的琼脂必须触感坚硬，并且在切下琼脂时不会碎裂。琼脂固化后，使用 1.5 厘米的软木蛀虫在每个板的琼脂凝胶上打一个中心孔。然后用新鲜的酵母酱整齐地填满孔。

要将幼虫转移到检测板上，请制作一个简单的工具。将曲线弯曲到塑料微刮刀的尖端，然后将尖端浸入酵母糊中，使其粘附在幼虫上。现在单独捡起第一龄幼虫，并将它们放在靠近食物丘的琼脂板上。对于每个实验组，至少准备 5 个板，每个板有 10 只幼虫。

为确保检测重复之间的可重复性，每个检测板上仅放置 10 只幼虫至关重要。请务必仔细检查检测板，以确定每次使用微刮刀尖端输送幼虫时，是否转移了一只且仅一只幼虫。

加载板后，贴上标签，盖上盖子，然后在室温下将其置于黑暗中，盖子面朝上。每天检查每个板，直到所有幼虫都死亡或化蛹。以下是从测定的第 2 天到第 8 天的野生型菌株板示例。第 2 天，幼虫被埋在食物中，没有发生隧道。隧道形成从第 3 天开始，并在第 5 天和第 8 天之间达到最大值，因为幼虫停止在隧道中徘徊并化蛹。

用弯曲的挑逗针小心地将蛹转移到葡萄盘上，如果需要，数一下有多少蛹。注意蛹的形成并评估蛹是否有异常。