Name: 生产转基因非洲爪蟾限制性内切酶介导的整合和核移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学习利用限制性内切酶介导整合和核移植技术生产转基因非洲爪蟾的方法。该技术通过将外源基因导入精子细胞核并移植到未受精卵中，实现基因在胚胎发育过程中的稳定表达，为发育生物学研究提供重要工具。

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我们的研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）、美国出生缺陷基金会（March of Dimes）和美国癌症协会提供资助。

该转基因方法的改良版本最初在1和2中被描述。
A. 精子细胞核制备
该细胞核制备方法改编自Murray3，但已省略蛋白酶抑制剂，因为它们会干扰后续精子细胞核移植卵子的发育。分装后于-80°C冷冻保存，可适用于移植实验约6个月。
所有溶液均应在开始制备前配制并置于冰上。
<ol>
 <li>将1-2只成年雄性X. laevis浸入三卡因（Tricaine）溶液中至少20分钟以进行麻醉，随后进行毁髓处理；取出睾丸。</li>
 <li>将睾丸在纸巾上轻轻滚动，去除血液、血管和脂肪组织，并在含有1×MMR的60 mm培养皿中短暂清洗，清除残留的脂肪组织。注意避免刺破睾丸，以免释放精子。</li>
 <li>将睾丸转移至干燥的60 mm培养皿中，用镊子充分研磨，直至无可见组织块。应尽可能彻底地进行研磨，以获得高产量的细胞核。</li>
 <li>向研磨物中加入2 mL冰冷的细胞核制备缓冲液（NPB；由储存液稀释至1×），并用移液器轻轻吹打混匀。</li>
 <li>将研磨物通过覆盖在漏斗上的四层纱布过滤，收集滤液至15 mL离心管（例如Falcon 2059）中；用8 mL NPB冲洗培养皿，并将冲洗液同样通过纱布过滤收集至同一离心管中。戴手套用手挤压纱布，以尽可能收集残留液体至管中。</li>
 <li>在4°C下，使用摆动桶转子（例如Sorvall HB-4转子或等效型号）以3000 rpm（约1480×g）离心10分钟，使精子沉淀。弃去上清液；向沉淀中加入8 mL NPB，使用10 mL移液器上下吹打以重悬沉淀；再次按上述条件离心并弃去上清液。在离心过程中将1 mL NPB平衡至室温。</li>
 <li>用1 mL移液器枪头将沉淀重悬于1 mL室温NPB中，加入50 μL新鲜配制的10 mg/mL溶血卵磷脂（lysolecithin），轻轻混匀，于室温孵育5分钟。</li>
 <li>向管中加入10 mL冰冷的1×NPB+3%BSA以终止溶血卵磷脂反应，轻轻混匀，然后在摆动桶转子中以3000 rpm离心10分钟。弃去上清液。经溶血卵磷脂处理后的沉淀应略显透明（较处理前不那么不透明的白色）。</li>
 <li>弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL冰冷的NPB+0.3%BSA中，用10 mL移液器轻轻混匀，按前述条件以3000 rpm离心10分钟。</li>
 <li>弃去上清液，将沉淀重悬于500 μL精子保存缓冲液中，并转移至1.5 mL离心管中。此即为细胞核储备液。置于冰上保存，并检测细胞核产量。</li>
 <li>为检测细胞核产量，取98 μL精子稀释缓冲液（SDB）、1 μL细胞核储备液和1 μL已按1:100稀释的Hoechst储存液，加入1.5 mL离心管中。在吸取1 μL储备液前，使用剪切过尖端（或大孔径）的移液器枪头充分混匀细胞核储备液。将稀释后的SDB/Hoechst/细胞核混合液充分混匀，利用毛细作用使少量液体流入改进型Neubauer血细胞计数板的计数室中。在复式显微镜下计数计数板中方格内的细胞核数量。来自一只雄性个体的细胞核产量，应在此1:100稀释条件下达到至少100–200（×104 个细胞/mL），即未稀释储备液浓度为1–2×105 个细胞/μL。若储备液浓度较低，可让细胞核静置数小时，去除部分上清液后重新计数。将细胞核在4°C下过夜保存，使甘油充分渗透，以利于后续冷冻保存；然后使用大孔径移液器枪头充分混匀细胞核储备液，分装为20 μL每份，置于液氮中速冻保存。</li>
</ol>
B. 高速提取物的制备
该方法改编自Murray3，可制备一种间期胞质提取物，能够促进加入的精子细胞核发生肿胀及部分染色质去凝集。提取物可分装成小份，于-80°C冷冻保存，使用前解冻即可。
<ol>
 <li>在hCG注射前3-5天，对8-12只成年雌性小鼠进行预处理 X. laevis 通过向背侧淋巴囊注射50单位PMSG。在提取物制备前一晚，每只青蛙注射500单位HCG，并将2只青蛙放入盛有2升1×MMR的容器中。由于一只青蛙产卵或卵子激活可能影响提取物的制备，建议将青蛙两两分组进行排卵。</li>
 <li>次日早晨，开始制备前先配制并预冷所有溶液。轻轻用手将每只青蛙的卵挤入盛有1×MMR的大烧杯中。对每个容器中的卵进行筛选，剔除出现花斑、裂解或激活迹象（表现为动物半球色素收缩）的卵批次。收集色素分布均匀且完整的卵。也可从青蛙饲养桶内的1×MMR溶液中收集状态良好的卵。卵的总体积应为 &gt;8–12 只雌性个体中提取的 100 mL</li>
 <li>去除卵胶。为此，先尽可能移除 MMR，加入少量半胱氨酸溶液并轻轻旋转卵子。在去胶过程中多次更换新鲜的半胱氨酸溶液。每批卵子应单独去胶，剔除有破损或已激活的批次。将剩余完好的卵子合并。</li>
 <li>用约 35 mL 提取缓冲液（XB）清洗卵子 4 次，然后用含蛋白酶抑制剂的 25 mL CSF-XB 清洗 2 次。</li>
 <li>装填卵子：将卵子转移至Beckman Ultraclear离心管中，静置使卵子沉降。尽可能吸除CSF-XB溶液。使用Beckman SW 40 Ti转子（或类似转子）以1000 rpm（约150g）离心约60秒，于 4°C去除压紧的卵块顶部多余的溶液。</li>
 <li>为了破碎卵子并制备胞质提取物：将卵子以10,000 rpm（16,000g）离心10分钟，温度为 4°C卵子应分为三层：脂质层（上层）、细胞质层（中层）和卵黄层（下层）。使用18号针头从每根离心管中收集细胞质层，将针头插入管内细胞质层底部位置进行抽取。将收集的细胞质转移至预冷的透明超清Beckman管中，并置于冰上。</li>
 <li>向分离得到的细胞质中加入蛋白酶抑制剂，使其终浓度为1X。在16,000g离心10分钟，温度为 4°C. 按照上述方法收集澄清的细胞质。预计每只青蛙可获得 0.75–1 mL 细胞质。</li>
 <li>向样品中加入相当于提取物体积1/20的能源混合物。将细胞质转移至适用于Beckman TL-100超速离心机的厚壁聚碳酸酯离心管中。每根离心管容量约为3 mL，装样时应至少装至半满。</li>
 <li>加入1 M CaCl₂2 向每支试管中加入试剂，使其终浓度为 0.4 mM。室温孵育 15 分钟。此步骤可灭活细胞质提取物中的 CSF，并使提取物进入间期。</li>
 <li>平衡离心管，并在 Beckman TL-100 超速离心机中使用 TLA-100.3 转子以 70,000 rpm（200,000 g）离心 1.5 小时，温度为 4°C细胞质将分为四层，从上到下依次为：脂质层、胞质溶胶、膜/线粒体层和糖原/核糖体层。</li>
 <li>从每根离心管中移除胞质层（若上样量为2-3 mL，则移除约1 mL），方法是将注射器穿过脂质层插入管顶部。将胞质组分转移至新的离心管中，随后将样品在70,000 rpm（200,000g）下于4°C离心20分钟 4°C.</li>
 <li>将上清液分装至25-μl 0.5 mL 离心管中分装。液氮速冻后于 -80 °C 保存80°C 直至使用。为确定提取物是否有效，可将精子细胞核在提取物中孵育，并用Hoechst染色，以检测在室温下加入后10分钟内细胞核是否出现明显肿胀（增厚并延长）。</li>
</ol>
C. 转基因反应与核移植
重要提示：开始反应前，请确保溶液、设备和青蛙均已准备就绪。一旦开始，必须按照下述大致时间表进行反应，因为许多组分无法长时间保持稳定 &gt;30分钟。在将精子核储备液置于冰上保存的同时，转基因反应体系（包括稀释和浓缩的反应液）应置于室温下保存。
<ol>
 <li>诱导雌性青蛙排卵。在转基因操作的前一晚，向数只（3–5只）成年雌性青蛙的背淋巴囊注射800单位HCG，以使其在次日清晨产出新鲜卵子。</li>
 <li>在进行转基因操作当天，准备或提前将所需溶液调节至适宜温度：
 <ol class="lalpha">
 <li>新配制的半胱氨酸溶液（2.5%溶于1×MMR，pH 8.0）。当天需准备数百毫升。</li>
 <li>用于移植培养皿及转基因胚胎恢复的0.2×MMR+6%Ficoll溶液，以及用于胚胎培养的0.2×MMR+100μg/mL庆大霉素（不含Ficoll）溶液。所有溶液温度不得超过18–21°C，且转基因胚胎在早期卵裂阶段应维持在16–21°C之间培养，因为较高温度会显著降低转基因效率并影响胚胎发育。</li>
 <li>将当日使用的SDB（精子稀释缓冲液）冻存 aliquot 解冻并平衡至室温，同时将高速提取物解冻后置于冰上，并配制100 mM MgCl2溶液。</li>
 <li>取出琼脂糖注射培养皿，加入含Ficoll的MMR溶液，并设置并预运行输注泵以稳定液体流速。</li>
 <li>检查雌性青蛙是否开始产卵，并评估卵子质量。理想状态下，卵子应具有坚实的皮层（去胶后能保持原有形态）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>配制转基因反应体系：
 <ol class="lalpha">
 <li>使用剪去尖端的移液枪头极其轻柔地混匀细胞核储备液，并在1.5 mL离心管中混合以下组分： 
 4 μL 细胞核悬液（约含4–8×105个细胞核） 
 2 μL 线性化质粒（100 ng/μL） 
 室温孵育5分钟。</li>
 <li>在上述孵育过程中，将0.5 μL限制性内切酶用4.5 μL H2O稀释，取1 μL稀释后的酶加入18 μL SDB、2 μL MgCl2和2 μL高速提取物中。将此混合液加入细胞核-质粒反应体系中，继续孵育10分钟以使细胞核充分膨胀。</li>
 <li>在此孵育期间，从2–3只青蛙中挤出卵子，并用半胱氨酸溶液去除胶质层。用1×MMR充分清洗卵子（5次），然后使用宽口移液枪头将400–500个去胶卵子转移至每个含有0.2×MMR+4%Ficoll的琼脂糖培养皿孔中。该过程通常耗时约10分钟，因此当卵子培养皿准备完毕时，反应体系也通常已准备好进行稀释。</li>
 <li>在步骤a开始后约15–20分钟，用剪去尖端的枪头轻柔混匀反应液（含细胞核/提取物/DNA），取约5 μL加入150 μL室温SDB中。稀释后的细胞核悬液在约1小时内保持稳定；而若保留在浓缩体系中，则其移植能力维持时间较短。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>装填显微注射针：使用宽口径移液枪头极其轻柔地混匀上述稀释后的反应液，立即装填至注射针中，因为细胞核在管中会迅速沉降。采用反向装填法时，将一小段细型Tygon软管连接至剪去尖端的200 μL移液枪头上，吸入溶液后，将软管连接至注射针，通过重力或轻压移液器活塞使溶液缓慢流入针内。</li>
 <li>将注射针连接至泵管并开始进行细胞核移植。注射操作应快速、浅层，并大致垂直于卵细胞质膜，以避免损伤卵子。按照建议流速（10 nL/秒），针尖在卵内停留时间约为0.5秒。应在20–30分钟内完成1–2个培养皿的移植操作。</li>
</ol>
注射后，将培养皿置于16-20°C环境中，直至胚胎发育至4-8细胞期。使用玻璃巴斯德吸管（其管尖直径与卵子相近）将正在卵裂的胚胎与其未卵裂的邻近胚胎分离，转移至含0.2XMMR加4%Ficoll的新大培养皿中。将卵裂的胚胎分入较小的组（每6孔板每孔10-15个胚胎），在含100μg/mL庆大霉素的0.2XMMR（不含Ficoll）培养基中继续培养至早期发育阶段。在原肠胚形成期间应检查胚胎，及时移除死亡胚胎，并根据需要更换培养基。
故障排除：
<ol>
 <li>针头堵塞：在移植过程中应能明显观察到针头中溶液的流动。如果针头被可见的颗粒物质堵塞，请更换针头，或尝试用镊子剪去针尖并推动溶液通过针头以清除异物。</li>
 <li>未获得卵裂卵：检查精子核稀释度和注射体积是否合适，并确认移植过程中针头未堵塞。如果注射体积过大，卵可能不会发生卵裂，反而出现色素异常或损伤。</li>
 <li>大量胚胎在原肠胚形成期间死亡。以下因素可提高胚胎存活率：
 <ol>
 <li>在制备核和酶促反应过程中需小心操作。去浓缩的核较为脆弱，应按照上述时间表进行移植。切勿将核置于冰上。</li>
 <li>精子核在酶促反应和核移植过程中所受的染色体损伤，会影响转基因频率以及胚胎的正常发育。核的染色体损伤可提高转基因效率，但对胚胎存活率和正常发育产生负面影响。减少或省略酶孵育过程中的限制性内切酶，可提高正常发育率，但可能降低转基因频率或进入胚胎基因组的质粒拷贝数。</li>
 <li>如果晚期囊胚至原肠胚阶段的胚胎出现色素异常或细胞死亡，可能是移植所用的某种试剂对卵具有毒性。此外，若卵的皮层不够坚固，可能发生外翻原肠胚（exogastrulation），无法形成正常的原肠胚后胚胎。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>表达转基因的胚胎数量较少。可增加限制性内切酶的用量。</li>
</ol>
代表性转基因胚胎结果
<img src="/files/ftp_upload/2010/2010fig1.jpg" alt="蝌蚪中的GFP表达，荧光显微镜，叠加图像，发育生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 通过核移植获得的转基因胚胎应培养至目标启动子的表达可见为止。在上方的图1中，肌动蛋白启动子驱动绿色荧光蛋白在该转基因蝌蚪的体节中表达。

<ol><li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li>
<li>Karaulanov, E., Knöchel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li>
<li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling%3A+a+mechanism+for+lens+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li>
<li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li>
<li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li>
<li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li>
</ol>

动物实验均依照华盛顿大学医学院动物护理与使用委员会制定的指南和规定进行。

对于每个待检测的转基因构建体，我们通常将细胞核移植到500-1000个卵中；在此规模下，每天可生成表达多达10种不同构建体的转基因胚胎，具体数量取决于诱导产卵的雌性个体数量。在这些移植操作中，约三分之一的卵能够进行卵裂，其中60-80%的卵裂胚胎能正常通过原肠胚形成阶段。根据所用反应条件的不同，这些胚胎中有10-50%会表达目标转基因。因此，一旦该实验流程在实验室中建立，单名操作人员即可在一天内生成表达多种不同质粒的转基因胚胎群体。转基因以串联多聚体形式（5-35个拷贝）整合到基因组中，因此该方法也可用于在单个胚胎中以较高频率（80-90%）将多个不同的转基因共整合到基因组中4。 本文所述的转基因方法已成功用于目的基因的异常表达、基因调控研究，以及生成在特定细胞或结构中表达标记物/荧光报告基因的胚胎（例如4-7）。转基因已可通过生殖系遗传8。最后，尽管本实验流程以Xenopus laevis为例进行演示，但也已适用于相关的二倍体物种Xenopus tropicalis9。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;高效生成转基因爪蟾胚胎的核移植方法&quot;&gt;A. 精子细胞核制备&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;试剂：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;1X MMR（2 mM CaCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5 mM HEPES，pH 7.5，2 mM KCl，1 mM MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，100 mM NaCl）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0.1% 三卡因甲磺酸盐（MS222，氨基苯甲酸乙酯，Sigma A-5040），0.1% 碳酸氢钠。溶于水中。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2倍核准备黄油液（2X NPB）。在制备精子核的当天，从冷冻保存的储备液中配制30 ml 2X NPB：500 mM 蔗糖（1.5 M 储备液），30 mM HEPES（1 M 储备液；用KOH调节至pH 7.7时浓度为15 mM），1 mM 亚精胺三盐酸盐（Sigma S-2501；10 mM 储备液），0.4 mM 精胺四盐酸盐（Sigma S-1141；10 mM 储备液），2 mM 二硫苏糖醇（Sigma D-0632；100 mM 储备液），2 mM EDTA（500 mM EDTA，pH 8.0）。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;使用2XNPB配制：a. 30 ml 1X NPB，b. 10 ml 1X NPB + 3% BSA（Fraction V，Sigma A-7906），c. 5 ml 1X NPB + 0.3% BSA。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;溶血卵磷脂：100 &amp;mu;10 mg/ml L-&amp;alpha;-溶血卵磷脂，蛋黄来源（Calbiochem，440154）；使用前室温溶解。固体储备物储存于 20 &amp;deg;C. 若储存粉末变黏，则应弃用。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;牛血清白蛋白（BSA）：10%（w/v）BSA（第五组分，Sigma A-7906）。在制备精子核当天，用5 ml水配制。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;精子保存缓冲液（1 ml）：1X NPB，30% 甘油，0.3% BSA。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;精子稀释缓冲液：250 mM 蔗糖，75 mM KCl，0.5 mM 亚精胺三盐酸盐，0.2 mM 精胺四盐酸盐。调至 pH 7.3–7.5，分装为 0.5–1 ml 份量，于 –20 °C 保存。 &amp;deg;C.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;H&amp;#8211;chst No. 33342 (Sigma B-2261)：10 mg/ml 储存液，溶于dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，置于避光容器中，于20℃保存 &amp;deg;C.&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;设备：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;li&gt;摆动桶转子和离心机&lt;/li&gt;&lt;li&gt;纱布&lt;/li&gt;&lt;li&gt;解剖工具（镊子和剪刀）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;荧光显微镜&lt;/li&gt;&lt;li&gt;漏斗&lt;/li&gt;&lt;li&gt;手套&lt;/li&gt;&lt;li&gt;血细胞计数板&lt;/li&gt;&lt;li&gt;针头（26 号）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;纸巾&lt;/li&gt;&lt;li&gt;培养皿（60 mm）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;移液管&lt;/li&gt;&lt;li&gt;塑料（5 和 10 ml）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Pipetman吸头（1 ml和200 μl）&amp;mu;l)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;注射器（1 ml）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;14 ml 离心管（Falcon，2059）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;管&lt;/li&gt;&lt;li&gt;微型离心机（1.5 ml）&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;通过核移植技术高效生成转基因爪蟾胚胎&quot;&gt;B. 高速提取物的制备&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;试剂：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;1X 马克氏改良林格液（MMR）：100 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，2 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5 mM HEPES，pH 7.5。配制10X储存液，并用NaOH调节pH至7.5。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;20X 提取缓冲液（XB）盐母液：2 M KCl，20 mM MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，2 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，经滤膜除菌后，4℃保存 &amp;deg;C.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;提取缓冲液（XB；新鲜配制并置于冰上）：1× XB 盐溶液、50 mM 蔗糖、10 mM HEPES（1 M 储存液，用 KOH 调节至稀释到 15 mM 时 pH 为 7.7；过滤除菌后分装，于 -20 °C 保存） &amp;deg;C). 准备约 100 ml。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2% (w/v) 盐酸L-半胱氨酸一水合物：使用前用1X XB盐溶液配制，并用NaOH调节至pH 7.8。准备约300 ml。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;CSF-XB：1X XB 盐，1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; （除 MgCl₂ 外）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 存在于 XB 盐溶液中；终浓度 2 mM），10 mM HEPES，pH 7.7，50 mM 蔗糖，5 mM EGTA，pH 7.7。配制 50 ml。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;蛋白酶抑制剂：亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、抑肽酶（chymostatin）和抑胃酶肽（pepstatin）的混合物，每种成分用二甲基亚砜（DMSO）溶解至终浓度为10 mg/ml。分装成小份，于-20℃保存。 &amp;deg;C.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;能量混合液：150 mM 磷酸肌酸，20 mM ATP，20 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;孕马血清促性腺激素（PMSG）：100 U/ml PMSG（P.G.600）&amp;#174;，Intervet公司，021825）。溶于水，于20℃保存 &amp;deg;C.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;人绒毛膜促性腺激素（HCG）：1000 U/ml HCG（CHORULON）&amp;#174;，Intervet, Inc.，057176）。溶于水，4℃保存 &amp;deg;C.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;设备：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;非洲爪蟾&lt;/em&gt; 雌性个体&lt;/li&gt; &lt;li&gt;针头（18 和 26 号）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;巴斯德吸管&lt;/li&gt; &lt;li&gt;宽孔径&lt;/li&gt; &lt;li&gt;注射器（1 mL）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;微量离心管（0.5 mL）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;厚壁聚碳酸酯管（Beckman，349622）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;超清晰离心管（14 × 95 mm；Beckman，344060）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;超速离心机及转子（例如 Beckman TL-100 配备 SW 40 Ti 和 TLA-100.3 转子）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;用于收集卵子的烧杯&lt;/li&gt; &lt;li&gt;用于盛放雌性青蛙的桶或容器（例如，4-L 带网盖塑料烧杯）。&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;通过核移植实现非洲爪蟾胚胎的高效转基因方法&quot;&gt;C. 核移植。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;试剂：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;0.1X MMR 中的 2.5% 琼脂糖（用于制备注射培养皿）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1XMMR 中含 2.5% 半胱氨酸，pH 8.0，现配现用&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Ficoll&lt;/li&gt; &lt;li&gt;10 mg/ml 庆大霉素（1000倍浓缩液）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;高速卵提取物（见上文）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;10X MMR（见上文）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;限制性内切酶（例如来自 New England Biolabs 的 NotI）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;精子稀释缓冲液（SDB；见上文）和精子核（见上文）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;人绒毛膜促性腺激素（HCG）如上所述&lt;/li&gt; &lt;li&gt;矿物油（Sigma，M8410）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;作为转基因引入的线性化质粒：制备浓度约为 100 ng/μL 的线性化质粒&amp;mu;l 在无菌、无核酸酶的水中（我们避免使用含Tris和EDTA的缓冲液，因为它们对胚胎具有一定的毒性）。用于线性化质粒的限制性内切酶&amp;#8211;所用的限制性内切酶不必与核移植反应中使用的相同。我们通常在所有反应中使用NotI，而无论线性化质粒时使用的是哪种酶。反应中所用酶的稀释度可能需要进行一些优化，因为酶用量过多可能对原肠胚形成后的发育产生不利影响。质粒可通过多种方法纯化：我们通常按照生产商的说明使用Qiagen Qiaquick PCR纯化试剂盒；无需从凝胶中回收单一条带。如果采用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法纯化质粒，务必彻底去除所有有机溶剂和乙醇残留。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;设备：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;用于注射的琼脂糖培养皿：在60 mm塑料培养皿中，将一个35 mm × 35 mm的小称量舟置于熔融的2.5%琼脂糖（溶于0.1×MMR水溶液）上，形成底部带有琼脂糖涂层的凹陷，用于盛放卵子。琼脂糖凝固后，用封口膜包裹，并于4 ℃保存。 &amp;deg;使用前置于冰上。每进行一次转基因反应，需预先制备2-3个培养皿。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;输注泵：我们使用哈佛仪器公司（Harvard Apparatus）的单筒注射泵，配备装有矿物油（Sigma M-8410）的3 cc注射器/针头。将注射器针头尖端弄钝（以防止刺穿管路），并连接细型Tygon管路。泵的流速设为约10 nl/sec；此流速假设针头在每个卵内的停留时间不超过1秒。在当天开始转基因操作前，应提前运行泵数分钟，以确保注射器推杆与活塞完全贴合，并且管路末端有稳定持续的正向油流。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;核移植用针的制备。使用显微拉针仪制备具有长斜尖端的针。在配有目镜测微尺的解剖显微镜下，用镊子剪切针尖，获得直径约80微米、呈斜面形状的开口。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;其他设备： &lt;em&gt;Xenopus laevis&lt;/em&gt; 雌性成体、体视显微镜、培养箱、显微操作仪、微注射针拉制仪（例如 Model P-87，Sutter）、注射器针头（26 号）、玻璃微注射针、目镜测微尺，用于校准剪切微注射针尖至 80&amp;mu;直径为 m 的培养皿、35 mm 称量舟、Tygon 软管（内径 = 1/32 英寸，外径 = 3/32 英寸）&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

通过限制性内切酶介导的整合与核移植技术生产转基因xenopus laevis

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

将克隆的基因产物稳定整合到Xenopus基因组中，对于控制基因表达的时间和空间特异性、在胚胎发育的后期阶段表达基因，以及明确增强子和启动子如何在胚胎内调控基因表达至关重要。本文所展示的方案可用于高效地制备转基因Xenopus laevis胚胎。该转基因方法包括三个部分：1. 通过溶血卵磷脂处理成年X. laevis睾丸组织以分离精子细胞核，该处理可使精子质膜通透化。2. 通过低速离心制备卵提取物，加入钙离子以促使提取物进入细胞周期的间期，再经高速离心以分离间期胞质溶胶。3. 核移植：将精子细胞核与卵提取物、线性化的质粒DNA（作为待导入的转基因）以及少量限制性内切酶混合。在短暂的反应过程中，卵提取物部分解凝聚精子染色质，同时限制性内切酶产生染色体断裂，促进转基因与基因组之间的重组。经处理的精子细胞核随后被移植至未受精卵中。转基因的整合通常发生在第一次胚胎卵裂之前，因此获得的胚胎不具嵌合性。这些胚胎无需繁殖至下一代即可进行分析，从而实现对启动子和基因功能研究所需的转基因胚胎的高效快速生成。通过该程序获得的成年X. laevis个体亦可通过生殖系传递转基因，可用于建立多种用途的转基因动物品系。

本视频方案演示了一种通过将转基因导入精子细胞核，随后将其移植到未受精卵中，从而生成转基因Xenopus laevis的方法。

通过限制性内切酶介导的整合与核移植技术生产转基因Xenopus laevis

将克隆的基因产物稳定整合到爪蟾基因组中，对于控制基因表达的时间和空间、在胚胎发育的后期阶段表达基因，以及明确增强子和启动子如何在胚胎内调控基因表达至关重要。此处展示的方案可用于高效地制备转基因非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎。该转基因方法包括三个部分：1. 通过溶血卵磷脂处理成年X. laevis睾丸组织以分离精子细胞核，该处理可通透化精子质膜；2. 通过低速离心制备卵提取物，加入钙离子使其进入细胞周期的间期，再经高速离心以分离间期胞质溶胶；3. 核移植：将精子细胞核与卵提取物、线性化的质粒DNA（作为待导入的转基因）以及少量限制性内切酶混合。在短暂的反应过程中，卵提取物使精子染色质部分去凝集，同时限制性内切酶在染色体上产生断裂，促进转基因与基因组之间的重组。处理后的精子细胞核随后被移植至未受精卵中。转基因的整合通常发生在第一次胚胎卵裂之前，因此所获得的胚胎不具有嵌合性。这些胚胎无需繁殖至下一代即可进行分析，从而实现对启动子和基因功能研究所需的转基因胚胎的高效、快速制备。通过该方法获得的成年X. laevis个体亦可通过生殖系传递转基因，可用于建立适用于多种用途的转基因动物品系。

为了研究爪蟾胚胎发育过程中的基因表达，必须将克隆的基因产物稳定整合到基因组中。首先从成年青蛙的睾丸中分离精子细胞核并使其通透化。然后从爪蟾卵中制备间期胞质提取物。将精子细胞核与卵提取物同线性化的转基因DNA以及限制性内切酶混合。在此步骤中，卵提取物使精子染色质部分去凝集，同时限制性内切酶促进转基因整合到基因组中。最后，将处理后的细胞核移植入未受精的卵细胞中。所获得胚胎的每个细胞均携带该转基因，且可通过免疫荧光显微镜或其他方法检测到启动子依赖性的转基因表达。与DNA显微注射等其他方法相比，该方法的主要优势在于，转基因在胚胎第一次卵裂之前即已完成整合。这意味着所获得的胚胎不具有嵌合性，因此无需进行繁育。采用本方案，可在短短几小时内快速高效地产生大量转基因胚胎。这些转基因胚胎可用于分析启动子或基因功能，也可通过繁殖建立转基因品系。通过将一至两只处死的青蛙的睾丸转移至干燥的60毫米培养皿中，开始本实验操作。使用镊子将睾丸充分研磨，直至无可见组织块为止。向匀浆中加入两毫升冷核提取缓冲液（NPB），轻轻吹打混匀，将匀浆通过四层纱布挤入漏斗中，并用15毫升离心管收集滤液。然后用八毫升NPB冲洗培养皿，并将冲洗液通过纱布过滤至同一离心管中。该溶液含有精子，操作时需佩戴手套。挤压纱布以收集剩余液体，将试管在4°C下离心10分钟，使精子沉淀。离心后，倾去上清液。然后加入8毫升NPB，上下吹打以重悬沉淀。再次离心；在离心过程中，将1毫升NPB升至室温。离心后，将沉淀重悬于1毫升NPB中，并加入50微升浓度为10毫克/毫升的新鲜配制的lyin以增加通透性。将精子混合物在室温下轻轻孵育5分钟。接下来，向试管中加入 10 毫升含 3% BSA 的冷的 1×MPB。为终止溶胞反应，离心收集经溶胞处理的精子。沉淀物应比处理前略显半透明。将沉淀物重悬于5毫升含0.3% BSA的冷NPB中，用10毫升移液器轻轻混匀以洗涤精子核，随后离心，弃去上清液，并将沉淀物重悬于500微升精子储存缓冲液中，转移至1.5毫升离心管。此为核储存液，将该管置于冰上以检测核的得率。在1.5毫升微量离心管中加入98微升精子稀释缓冲液、1微升核储存液以及1微升1:100稀释的hux储存液。充分混匀。使用移液器通过毛细作用将少量液体引入血细胞计数板的计数室中。在复式显微镜下计数细胞核。一只雄性个体应可获得 5000 万至 1 亿个细胞。将细胞核置于 4 摄氏度环境中过夜，以使甘油充分渗透，利于后续更好地进行冷冻保存。液氮速冻的等分试样储存在零下80摄氏度。从8到12只青蛙中收集的去膜卵需转移至烧杯中，用约35毫升提取缓冲液洗涤四次，再用含蛋白酶抑制剂的细胞周期阻滞因子提取缓冲液（C-S-F-X-B）25毫升洗涤两次，以浓缩卵子，随后将其转移至Beckman UltraClear离心管中。静置使卵子沉降。尽可能去除 C-S-F-X-B，并在 150 G 下离心约 60 秒。离心后，移去紧实卵顶部的过量溶液。随后，为了破碎卵并制备胞质提取物，在 4 摄氏度下以 16,000 G 离心 10 分钟，此时卵应分为三层。上层为脂质层，中间层为细胞质，下层为卵黄。将连接有注射器的18号针头插入管底中间层位置，吸取细胞质溶液。将溶液转移至预冷的洁净UltraClear Beckman离心管中，置于冰上。向分离的细胞质中加入蛋白酶抑制剂，使其终浓度为1×。在16,000 G下离心10分钟，制备细胞质组分。在 4 摄氏度条件下，将澄清的细胞质转移至新离心管中。每只青蛙预计可获得 0.75 至 1 毫升细胞质。接下来，向样品中加入相当于提取物体积二十分之一的能源混合液。将细胞质转移至厚壁聚碳酸酯管中。进行超速离心时，向每根管中加入一摩尔氯化钙，使其终浓度为0.4毫摩尔，在室温下孵育15分钟，这会抑制细胞静止因子并促使提取物进入间期，随后进行离心。在超速离心机中，于 4°C 下以 200,000 G 离心一个半小时后，细胞质将分为四层，从上到下依次为：脂质层、胞质溶胶层、膜层以及线粒体、糖原和核糖体层。将注射器插入管子顶部，吸出胞质溶胶层。体积应约为一毫升。若上样量为二至三毫升，则将胞质组分转移至新的离心管中，在 4°C 条件下以 200,000 ×g 离心 20 分钟，然后将上清液分装至 0.5 毫升离心管中，每管 25 微升。用液氮快速冷冻分装样品，并于 -80°C 保存备用。为建立转基因反应，使用剪去尖端的移液枪头轻轻混合核储存液，并在1.5毫升微量离心管中加入4微升核溶液和2微升线性化质粒。在室温下孵育5分钟，同时进行孵育。将0.5微升限制性内切酶用4.5微升水稀释。然后将一微升稀释后的酶加入到18微升精子稀释缓冲液、两微升氯化镁和两微升高速提取物中。将此混合物加入核-质粒反应体系。继续孵育10分钟，使细胞核在此孵育过程中膨胀。从两只到三只雌性青蛙获得的卵在1倍XMMR中脱胶并清洗五次。使用宽口移液管将400至500个脱胶卵转移至每个含有0.2倍XMMR和4%fi的琼脂糖培养皿中。在开始转基因反应后约15至20分钟进行操作。使用EC截短尖端轻轻混合细胞核、提取物与DNA反应液，并取五微升反应液加入到150微升室温的精子稀释缓冲液中，以完成注射针的后向加样。将一小段细TIG管套在EC截短的200微升移液器吸头末端。吸取溶液。然后将管路连接到针头，并通过重力使溶液进入针头。将针头连接到泵的管路上。将卵置于显微镜载物台上，然后迅速将针插入第一个卵。注射应浅层进行，并大致垂直于 X 的质膜。为避免损伤，将针头在卵细胞内保留约 0.5 秒。以每秒约 20 纳升的速度加样，可在 20 至 30 分钟内完成一到两皿的移植操作。注射后，将培养皿置于 16 至 20 摄氏度环境中，直至胚胎发育至四到八细胞阶段。通过核移植获得的转基因胚胎应培养至目标启动子的表达在本图中可见。该转基因蝌蚪中，肌动蛋白启动子驱动绿色荧光蛋白在体节中表达。观看本视频后，您应充分掌握如何利用精子细胞核的核移植技术来制备转基因爪蟾胚胎。该方法已成功应用于爪蟾属（opus lavis）的转基因研究，但经过少量修改后也可适用于扎氏热带爪蟾（zap tropic）。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

生产转基因非洲爪蟾限制性内切酶介导的整合和核移植

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利用分离的非洲爪蟾卵提取物进行体外核组装

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非洲爪蟾卵母细胞的显微注射

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利用带有galK可筛选标记的重组工程法构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）转基因

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操作与 体外 成熟 非洲爪蟾 卵母细胞，继以胞质内精子注射，用于研究胚胎发育

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斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

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通过限制性内切酶介导的整合与核移植技术生产转基因Xenopus laevis

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