双光子激光诱导神经损伤：一种在Drosophila幼虫中观察轴突变性与再生的方法

- 开始 由 封片 a 清洁 麻醉的 幼虫 在……下方 a 玻璃 盖子 滑动 与 它的 头部 向上 接下来， 暴露 的 面积 的 兴趣 由 轻柔地 推动 的 盖玻片 到 滚动 的 幼虫 和 调节 它的 位置。 使用 共聚焦 成像 到 定位 的 幼虫 神经的 细胞 识别 a 特异的 轴突 开启 一 的 的 目标 神经 细胞 作为 的 位点 用于 损伤

然后 暴露 的 目标 轴突 到 a 双光子 激光 在 a 较高 功率 比 使用 用于 成像 到 诱导 损伤。 A 双光子 激光 是 使用 由于 到 它的 能力 到 穿透 和 精确地 定位 损伤 在……之内 活体 组织 与 最低限度的 损伤 到 周围 组织

停止 的 激光 暴露 立即 当 那里 是 损伤 到 的 目标 神经元, 导致 在 轴突切断术， 或 切断 的 的 轴突 最后， 图像 的 受伤的 神经元 到 查看 它的 退变 和 随后的 再生 在 的 期望的 时间 点。

在 本 示例 实验方案中，我们 将 对 一 条 幼虫 进行显微镜载片处理，诱导 其 感觉 神经元 发生 损伤，并 追踪 神经 再生过程。

- 开始 与 一个 麻醉 的 幼虫 在 a 烟雾 通风橱， 位置 a 60 毫米 玻璃 培养皿 进入 a 15厘米 塑料 培养皿 培养皿 然后 折叠 a 块 的 组织 纸张 和 位置 它 在 的 玻璃 培养皿 放置 的 葡萄 琼脂 培养皿 在 的 组织 之后 的 二乙基 乙醚 是 添加。

接下来， 到……上 a 玻璃 载玻片 位置 一 滴 的 卤代烃 27 油 在 的 中心 和 位置 a 斑点 的 真空 润滑脂 在 每个 的 的 四 角落 然后 使用 镊子 到 转移 一 幼虫 到……上 的 琼脂 培养皿 和 盖子 的 玻璃 培养皿 到 麻醉 的 幼虫 作为 很快 作为 的 熔岩 停止 移动， 仔细地 转移 它 到 的 卤代烃 油 与 它的 头部 直立。 然后 位置 a 盖子 滑动 结束 的 载玻片 和 按压 它 向下 轻柔地 直到 它 接触 的 幼虫

接下来， 使用 温和的 力 到 载玻片 的 盖玻片 到 滚动 的 细胞 到 是 消融的 到 其中 的 双光子 激光 将 大多数 轻松地 击中 它们。 的 位置 将 变化 取决于 开启 什么 神经元 是 是 靶向的 现在 固定 的 组装 在 的 双光子 显微镜 载物台 和 焦点 开启 的 细胞 的 兴趣 使用 a 40x 油 浸润 目的

在 的 软件， 开关 到 的 扫描 模式 和 加载 的 已保存 实验方案 制作 当然 的 针孔 是 打开 全部 的 方法。 然后， 在 活体 模式， 获取 a 良好 图像 的 的 区域 的 兴趣。

接下来， 停止 的 活体 扫描 因此 那 的 作物 按钮 将 成为 可用。 使用 的 切割 功能, 调节 的 扫描 窗 到 焦点 的 目标 面积 在 仅 的 前瞻性 位点 的 损伤 然后 开放 a 新 成像 窗口 现在 减少 的 扫描 速度 和 增加 的 激光 强度 然后 切换 的 连续的 按钮 到 开始 和 停止 的 扫描 观看 仔细地。 作为 很快 作为 那里 是 a 剧烈的 增加 在 荧光 结束 的 扫描

接下来， 切换 返回 到 的 原始 成像 窗 和 选择 的 活体 模式， 和 找到 的 区域 那 是 仅 靶向的 由 调整 的 焦点

- A 好 适应证 的 成功 损伤 是 的 外观 的 a 小 撞击坑 环状 结构， 或 局部的 碎片 右侧 在 的 损伤 位点。 如果 的 激光 功率 是 太 高 a 大 受损区域 会 是 可见的 哪个 能 是 致命的。

- 现在 仔细地 移除 的 盖玻片， 和 转移 的 受伤的 幼虫 到……上 a 新 培养皿 与 酵母 粘贴。 放置 的 培养皿 进入 a 60 毫米 培养皿 沿 与 a 丙酸 酸浸泡的 组织 然后 返回 的 培养皿 到 培养 温度

对于 随后的 成像 的 的 幼虫， 制作 使用 的 的 已保存 共聚焦 设置 和 收集 z 堆栈 图像 与 a 25x 目的 是 确定 到 包括 的 标准化 点 因此 的 再生 能 是 定量。