Mikroinjection af Drosophila sygeplejerskeceller: En metode til intracellulær levering

- Placer en coverlip med dissekeret æg kamre på mikroskop fase. Find et æg kammer af passende udviklingsstadium og orientering for mikroinjection. Mid til sene-fase æg kamre har en stor synlig oocyt æggeblomme, og dem i den korrekte retning er med deres forreste-bageste akse vinkelret på retningen af injektion.

Drosophila nerveceller er en gruppe på 15 celler inde i ægget kammeret ansvarlig for deponering maternally afledte næringsstoffer og biomolekyler i udviklingslandene oocyt. Sæt microinjector system til passende injektion og kompensation pres for at sikre konsekvent injektion volumen og ydre flow. Omhyggeligt bringe en tidligere lastet kapillær nål ind i synsfeltet, således at celler og nål er i samme brændplan.

Sørg for, at der ikke er luft fanget i spidsen af kapillæren, og at der er en kontinuerlig strøm af opløsningen. Juster derefter Z-positionen af målet for at fokusere på membranen, der adskiller follikelcellerne fra sygeplejerskecellerne, indsæt nålen i en sygeplejerskecelle og udfør injektionen.

Følgende protokol demonstrerer microinjecting Drosophila sygeplejerske celler med fluorescerende oligonukleotid sonder, kaldet molekylære beacons, mod maternally bidraget mRNA udskrifter for levende celle billeddannelse.

- For molekylær beacon mikroinjection, skal du vælge 40x olie mål og montere et dæksel slip med dissekeret æg kammer på mikroskop fase. Find et æg kammer i midten til slutningen af udviklingsstadiet, der er korrekt orienteret for mikroinjection, derefter oprette en mikroinjektor med passende injektion og kompensation pres.

Brug mikromanipulator joysticket, forsigtigt sænke en nål fyldt med en mikroliter af molekylær beacon løsning i olie dråbe. Bring spidsen i fokus mod periferien af synsfeltet. Udfør en ren funktion til at fjerne luften fra nålen spidsen og for at sikre, at der er flow fra nålen, og bringe nålen til hjemmet position.

Fokuser på æggekammeret, der skal mikroin injiceres, og bring nålen tilbage i fokus nær kanten af ægkammeret. Udfør en fin justering af Z-positionen af målet, således at membranen, der adskiller follikelcellerne fra sygeplejerskecellerne, er i fokus. Indsæt nålen i en sygeplejerskecelle til injektion af de molekylære beacons over en periode på to til fem sekunder.

- For at sikre reproducerbar mikroinjection succes, fokusere omhyggeligt på membranen adskille follikelceller og sygeplejerske celler, der vil blive injiceret, samtidig med at spidsen af nålen i fokus med mikromanipulator.

- Når alle de molekylære beacons er blevet injiceret, skal du forsigtigt fjerne nålen og trække den tilbage til hjemmepositionen. Skift målet til den ønskede forstørrelse for billederhvervelse, fokuser derefter på ægkammeret under det nye mål og begynd billederhvervelsen.