ड्रोसोफिला नर्स कोशिकाओं का माइक्रोइंजेक्शन: इंट्रासेल्युलर डिलीवरी की एक विधि

- माइक्रोस्कोप चरण पर विच्छेदित अंडे के कक्षों के साथ एक कवरलिप रखें। माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपयुक्त विकासात्मक चरण और अभिविन्यास के अंडे के कक्ष का पता लगाएं। मध्य से देर तक अंडे के कक्षों में एक बड़ा दृश्यमान ओसाइट जर्दी होता है, और सही अभिविन्यास में वे इंजेक्शन की दिशा के लंबवत अपने पूर्वाकार-पीछे की धुरी के साथ होते हैं।

ड्रोसोफिला तंत्रिका कोशिकाएं अंडे के कक्ष के अंदर 15 कोशिकाओं का एक समूह है जो मातृ व्युत्पन्न पोषक तत्वों और जैव अणुओं को विकासशील ओसाइट में जमा करने के लिए जिम्मेदार है । लगातार इंजेक्शन की मात्रा और जावक प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त इंजेक्शन और मुआवजे के दबाव के लिए माइक्रोइंजेक्टर प्रणाली स्थापित करें । ध्यान से देखने के क्षेत्र में पहले से भरी हुई केपिलरी सुई लाने के लिए इतना है कि कोशिकाओं और सुई एक ही फोकल विमान में हैं ।

सुनिश्चित करें कि केशिका की नोक में कोई हवा नहीं फंसी है और समाधान का निरंतर प्रवाह होता है। फिर नर्स कोशिकाओं से कूप कोशिकाओं को अलग करने वाली झिल्ली पर ध्यान केंद्रित करने के उद्देश्य की जेड-स्थिति को समायोजित करें, सुई को नर्स सेल में डालें और इंजेक्शन का प्रदर्शन करें।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के साथ ड्रोसोफिला नर्स कोशिकाओं को दर्शाता है, जिसे आणविक बीकन कहा जाता है, लाइव सेल इमेजिंग के लिए मातृ योगदान एमआरएनए टेप के खिलाफ।

- आणविक बीकन माइक्रोइंजेक्शन के लिए, 40x तेल उद्देश्य का चयन करें और माइक्रोस्कोप चरण पर विच्छेदित अंडे के कक्ष के साथ एक कवर स्लिप माउंट करें। मध्य से देर तक विकास के चरण में एक अंडा कक्ष का पता लगाएं जो माइक्रोइंजेक्शन के लिए ठीक से उन्मुख है, फिर उचित इंजेक्शन और मुआवजे के दबाव के साथ एक माइक्रोइंजेक्टर स्थापित करें।

माइक्रोमैनीपुलेटर जॉयस्टिक का उपयोग करके, तेल की बूंद में आणविक बीकन समाधान के एक माइक्रोलीटर से भरी हुई सुई को धीरे-धीरे कम करें। टिप को देखने के क्षेत्र की परिधि की ओर ध्यान केंद्रित करें। सुई टिप से हवा को हटाने के लिए एक स्वच्छ कार्य करें और यह सुनिश्चित करें कि सुई से प्रवाह हो, और सुई को घर की स्थिति में लाएं।

अंडे के कक्ष पर ध्यान केंद्रित करें, और सुई को अंडे के कक्ष के किनारे के पास ध्यान में वापस लाएं। इस उद्देश्य की जेड-स्थिति का ठीक-ठाक समायोजन करें ताकि नर्स कोशिकाओं से कूप कोशिकाओं को अलग करने वाली झिल्ली ध्यान में रहे। दो से पांच सेकंड की अवधि में आणविक बीकन के इंजेक्शन के लिए सुई को नर्स सेल में डालें।

- प्रजनन योग्य माइक्रोइंजेक्शन सफलता सुनिश्चित करने के लिए, कूप कोशिकाओं और नर्स कोशिकाओं को अलग करने वाली झिल्ली पर ध्यान केंद्रित करें जिन्हें इंजेक्शन दिया जाएगा, जबकि सुई की नोक को माइक्रोमैनीपुलेटर के साथ ध्यान में लाते हैं।

- जब सभी आणविक बीकन इंजेक्शन दिए गए हैं, तो धीरे-धीरे सुई को हटा दें और इसे घर की स्थिति में वापस ले लें। छवि अधिग्रहण के लिए वांछित आवर्धन के उद्देश्य को बदलें, फिर नए उद्देश्य के तहत अंडे के कक्ष पर ध्यान केंद्रित करें और छवि अधिग्रहण शुरू करें।