筛选基因组修饰：一种在Drosophila中鉴定CRISPR诱导突变体的方法

- 当 注射 胚胎 开发 进入 G0 成人， 交叉 全部 个体 果蝇 到 合适的 平衡染色体 储备液 到 展开 潜力 F1 CRISPR 已编辑 线条 和 是 能够 到 追踪 的 遗传 的 的 基因组的 修饰 然后， 交叉 随机地 选定 F1 单个 雄性 到 合适的 平衡染色体 雌性 到 是 能够 到 回收 后代 如果 一个 F1 男性 是 阳性 用于 的 突变 一旦 的 交叉 具有 采取 转移 的 F1 雄性 到 a 管 用于 筛选

为了 提取 基因组的 DNA 压片 的 果蝇 与 a 移液器 尖端 含有 提取 缓冲液 一旦 的 组织 是 破碎的 向下 弹出 的 液体 的 提取 缓冲液 含有 蛋白酶 K, 一个 酶 那个 消化产物 蛋白质 在 的 样本 和 是 灭活的 由 高 热

现在 那个 DNA 是 可及的 继续 到 PCR 筛选 对于 例如， 使用 引物 设计 到 扩增 a 区域 那 包括 的 新 序列 仅 在 的 存在 的 的 修饰 将 的 第二 引物 结合 和 a PCR 产品 是 扩增。 在 的 例如， 我们 将 见 果蝇 是 繁殖 和 筛选 由 PCR 用于 插入 的 a 转录激活 序列 替换 的 首先 外显子 的 的 无分支 基因

- 当 nos-Cas9 胚胎 此前 注射 与 两者 的 指南 RNA 表达 质粒 和 的 替换 供体 开发 进入 成人， 交叉 G0 果蝇 单独地 到 平衡染色体 果蝇 从 a 线 适当的 用于 的 靶向的 等位基因 麻醉 的 F1 后代 从 每个 G0 交叉 在 a 碳 二氧化物 垫 和 随机地 挑选 10 到 20 雄性 在……下方 a 立体 显微镜 单独地 交叉 每个 已选 男性 到 a 平衡染色体 女性 从 a 线 适当的 用于 的 靶向的 等位基因

当 的 F2 幼虫 孵化， 挑选 的 F1 父亲 从 每个 交叉 提取 基因组的 DNA 由 压碎 每个 果蝇 用于 10 到 15 秒 与 a 移液器 尖端 含有 50 微升 的 压碎 缓冲液 无 分配 的 缓冲液 然后， 分配 的 剩余 缓冲液 进入 的 管 和 混合 好。

孵育 在 37 度 摄氏度 用于 20 到 30 分钟 随后 的 孵育， 位置 的 管 在 95 度 摄氏度 热 阻断 用于 1 到 2 分钟 到 灭活 的 蛋白酶 K. 之后 旋转 向下 用于 5 分钟 在 10,000 次 克， 储存 的 制备 在 4 度 摄氏度 用于 进一步 PCR 分析。

执行 三步法 PCR 基于 屏幕 使用 引物 正向 1 和 反转 1 到 屏幕 用于 的 存在 的 的 插入 或 替换 执行 PCR 使用 正向 2 和 反转 2 引物 到 验证 的 插入 或 替换 从 三 引物 区域 执行 PCR 使用 引物 M13F 和 反转 3 至 检查 末端 HDR

- 保持 的 果蝇 线条 与 的 已确认 末端外切 HDR 和 建立 天平 储备液 从 F2 生成 杂交 的 平衡染色体 果蝇 再次 到 移除 任何 非预期的 突变 在 其他 染色体