体内果蝇钙成像:一种神经元活动功能成像的方法

- 为了在果蝇神经系统中进行体内钙成像，将基因编码的钙指示剂（如 GCaMP）的表达靶向目标神经元。当神经元激发动作电位时，膜的快速去极化导致电压门控钙通道打开，导致细胞外钙流入细胞。

GCaMP 是一种融合蛋白，其中增强的绿色荧光蛋白 （EGFP） 被修饰并融合到 N 端肌球蛋白轻链的 M13 片段和 C 端的钙结合蛋白钙调蛋白上。钙与钙调蛋白结合，触发 GCaMP 的构象变化，导致蛋白质荧光增加。

为了对 GCaMP 荧光的变化进行成像作为体内神经元活动的代理，暴露具有预期活动的神经系统区域。然后，使用可以捕获 GCaMP 动力学并配备刺激物递送装置的荧光显微镜。传递刺激，例如气味，同时记录响应神经元中的 GCaMP 荧光。

在示例协议中，我们将看到 GCaMP 功能成像用于可视化嗅觉联想学习期间大脑蘑菇体的反应。

- 为了可视化基于 GFP 的钙指示剂，将配备红外激光器和水浸物镜（安装在隔振台上的）的多光子显微镜的激光器调谐到 920 纳米的激发波长，并安装 GFP 带通滤光片。使用粗略的 Z 调节旋钮，扫描大脑的 z 轴以找到感兴趣的大脑区域。使用裁剪功能将扫描仅集中在感兴趣的区域上，以最大限度地减少扫描时间，并旋转扫描视图，使头部的前部朝下。然后，将帧大小调整为 512 x 512 像素并选择要扫描的区域，同时考虑为每个帧计算的扫描时间，以实现至少 4 赫兹的帧速率。

对于气味诱发的钙瞬时可视化，启动一个预编程的宏包，能够将图像采集软件和气味输送程序联系起来，并在显微镜软件中开始测量 6.25 秒，以建立 F0 基线值。在气味传递系统中，提供 2.5 秒的气味刺激，此处由 LED 点亮指示，由特定气味杯阀的打开和关闭触发，然后在气味偏移结束时进行 12.5 秒的记录。然后，以相同的方式重复第二种和第三种加臭剂的递送。

要在此设置中执行联想条件反射，请使用计算机控制的气味传递系统，将条件刺激和气味呈现 60 秒，以及 12 个 90 伏电击。休息 60 秒后，单独呈现条件刺激减去气味 60 秒，不要触电。在完成训练阶段后 3 分钟重复训练前气味刺激方案，再次测量训练后气味诱发的钙瞬变。然后，以适当的格式保存成像文件以供以后的图像分析。