卡诺哈布迪炎的单细胞分离:分离活细胞的方法

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- 从洗涤的沉淀蠕虫开始,加入含有 SDS(去污剂)和 DTT(还原剂)的裂解缓冲液。这会破坏蠕虫的保护性角质层,使身体暴露出来进行细胞解离。避免长时间暴露于裂解缓冲液中,以尽量减少细胞裂解和死亡。

接下来,用冷分离缓冲液洗涤几次去除裂解试剂。重要的是,该缓冲液必须具有正确的渗透压以防止细胞死亡。使用蛋白酶分解细胞间的连接。通过将混合物移液到管壁上,帮助均匀化过程以及机械能。

添加含有血清的培养基以阻止酶反应和抗生素以防止污染。沉淀并洗涤样品数次以去除大部分碎屑。

最后,将试管放在冰上,让重力沉降。包括角质层或细胞团块残留物在内的碎片会沉淀下来,而解离的细胞仍然悬浮在培养基的顶层。这些细胞可用于短期培养或通过 FACS 或免疫沉淀分离特定细胞群。

在示例方案中,我们将在感兴趣的神经元中解离表达 GFP 的转基因蠕虫,以分离和分析这些细胞。

- 收集动物后,以 1,600 倍 g 离心 5 分钟。去除所有上清液,将蠕虫重新悬浮在 1 毫升 M9 培养基中。将悬浮液转移至 1.5 mL 微量离心管中。

以 1,600 倍 g 离心 5 分钟,使蠕虫沉淀。然后,加入 200 μL SDS-DDT 缓冲液,并在室温下孵育 5 分钟。如果在光学显微镜下观察,蠕虫现在应该沿着身体出现皱纹。

接下来,加入 800 微升冰冷的分离缓冲液,轻轻弹动试管混合。以 13,000 倍 g 和 4 摄氏度离心 1 分钟以沉淀蠕虫。去除上清液,用 1 毫升分离缓冲液洗涤。

重复此离心和洗涤过程总共五次,确保每次都小心地去除分离缓冲液。在此之后,向沉淀中加入 100 微升溶解在分离缓冲液中的灰色链霉菌蛋白酶混合物。

在室温下孵育 10 至 15 分钟。确保使用 200 微升微量移液器吸头抵住试管底部上下移液 60 至 70 次,以施加机械破坏。为了确定消化阶段,取出 1 至 5 μL 的消化混合物,将其滴在载玻片上,并使用组织培养显微镜进行检查。

5 到 7 分钟后,蠕虫碎片的角质层应明显减少,并且细胞浆液将很容易看到。通过添加 900 微升市售的 Leibovitz's L15 培养基,补充有 10% FBS 和青霉素-链霉素来终止反应。

以 10,000 倍 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟,以沉淀分离的片段和细胞。用补充了 L15 的冷培养基再洗涤沉淀的细胞两次,每次洗涤 1 毫升培养基。将沉淀的细胞重悬于 1 mL 补充 L15 的培养基中,并在冰上放置 30 分钟。

然后,取大约 700 至 800 微升的顶层,将其转移到微量离心管中。使用自动细胞计数仪或血细胞计数器测量 10 至 25 μL 分离细胞的细胞密度。

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最后更新:1 八月 2026