用于秀丽隐杆线虫饲喂的 RNAi 铺板:一种在大肠杆菌中诱导靶标 dsRNA 表达的技术

- 在秀丽隐杆线虫中，可以通过喂养来自重组 DNA 质粒的表达双链 RNA 或 dsRNA 的蠕虫细菌来诱导 RNAi。

首先，在含有四环素和氨苄青霉素或其功能性类似物羧青霉素的选择性 LB 琼脂平板上培养转染 L4440 质粒的四环素抗性 HT115 大肠杆菌过夜。除了靶 DNA 外，质粒还包含一个氨苄青霉素抗性基因。只有继承质粒的细菌菌落才能在这些抗生素存在下生长。

接下来，收获细菌菌落并将其在液体 LB 培养基中扩增至所需浓度。为了诱导 dsRNA 表达，将细菌溶液转移到制备的线虫生长培养基或 NGM、含有 IPTG 的琼脂平板上。

在该表达系统中，IPTG 模拟乳糖以灭活 lac 阻遏蛋白，从而实现 T7 RNA 聚合酶的表达。在质粒上，靶标 DNA 表达受两个趋同的 T7 启动子的调节。因此，正义和反正义序列被转录，导致 dsRNA 的表达。

最后，蠕虫使用来自摄入的 dsRNA 的序列信息来下调具有互补序列的内源性 mRNA。在本实验中，我们将制备带有转基因大肠杆菌的 RNAi 板，用于秀丽隐杆线虫饲喂。

- 对于 RNAi 板，用含有 IPTG 和羧苄青霉素的 NGM 琼脂加载 6 厘米板。让它们在室温下避光干燥 24 至 48 小时。然后，将它们转移到 4 摄氏度长达 14 天。

接下来，用带有携带 lin-53 基因的 L4440 质粒的 RNAi 细菌克隆在含有羧苄青霉素和四环素的选择性板上划线。使用三相条纹模式，并确保电镀空矢量对照。然后，将板在 37 摄氏度下培养过夜。

第二天，挑选至少三个单菌落，并将其每个菌落接种到单独的培养管中，加入 2 毫升补充有羧苄青霉素的 LB，但不包括四环素。计划每种病症有 3 个健康培养物。

接下来，将培养物在 37 摄氏度下培养过夜，直到它们达到 0.6 至 0.8 的 600 纳米光密度。然后，将 500 微升每种细菌培养物添加到 6 厘米 NGM 琼脂 RNAi 板中。将板在室温下避光孵育过夜。