在液体培养中进行RNAi饲喂：一种在 C. elegans 中敲低基因表达的高通量方法
0 次观看 • 3:15 分钟 • April 30th, 2023
- 至 开始， 添加 羧苄青霉素 和 一 毫摩尔（mM） IPTG 到 对照 和 测试 培养 烧瓶 含有 S 基础的 培养基 离心 a 管 含有 幼虫 在 生长 阶段 一， 也 称为 L1 幼虫， 用于 a 少数 分钟 现在 移除 的 上清液 和 位置 二 微升 的 L1s 开启 一个 琼脂 板 放置 的 培养皿 下 a 解剖 显微镜 和 计数 的 数量 的 幼虫
添加 RNA干扰 细菌 携带 a 非特异性 RNA干扰 质粒 至 的 对照 烧瓶 和 细菌 与 基因- 靶向 RNAi 到 的 测试 烧瓶 这 量 的 细菌 添加 应该 是 成比例的 到 的 数量 的 线虫。
让 的 幼虫 生长 与 连续的 振荡 到 确保 正确的 氧合 这 幼虫 喂养 在 的 细菌 内部 的 幼虫 的 小 干扰 RNA 结合 到 的 互补的 mRNA 产生 由 的 靶向的 基因 和 抑制 蛋白 表达 最后， 检查 的 线虫 用于 你的 表型 的 兴趣。
在 的 示例 方案 我们 将 处理 L1 幼虫 与 RNAi 靶向 的 daf-2 基因 在 液体 培养。
- 至 开始 治疗 添加 207.45 毫升 的 S 基础的 培养基 与 额外的 试剂 作为 描述 在 的 伴随的 text 实验方案 到 a 2,800 毫升 Fernbach 培养 烧瓶 添加 a 最终 浓度 的 50 微克 每 毫升 的 羧苄青霉素 和 1 毫摩尔（mM） 的 IPTG, 和 关闭 的 烧瓶 与 a 膜 螺钉 帽
取 的 L1s 出 的 的 25 度 摄氏度 培养箱 和 转移 它们 至 15 毫升 管 离心 的 L1s 在 1,900 次 g 用于 三 分钟 之后 旋转， 移除 的 上清液 下 a 显微镜, 计数 的 L1s 每 二 微升, 和 平均值 的 数字 获得 从 在 最少 九 滴
接下来， 将 50,000 条线虫 用于 the 年轻 线虫 收集 以及 100,000 条线虫 用于 the 衰老 线虫 收集 分入 四个 Fernbach 培养瓶 中 ，上述培养瓶 在 the 前一步 骤中已准备好。 然后 按 控制 RNAi 细菌 和 RNAi 细菌 与 the 目标 基因 相对应 的比例 添加至 the 线虫 的 数量。
之后 添加 细菌 完整 蠕虫 培养 与 S 基础的 至 带来 的 总计 体积 到 300 毫升 孵育 的 线虫 培养 在 25 度 摄氏度 在 a 振荡 培养箱 与 150 RPM 直到 收集
概述
本文介绍了一种利用RNA干扰（RNAi）在L1幼虫中研究基因功能的实验方案。重点是靶向daf-2基因，以观察其对表型的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 发育生物学
背景
- RNA干扰是基因沉默的一种强大工具。
- daf-2基因已知在发育和衰老过程中发挥作用。
- L1幼虫是研究基因功能的模式生物。
- 本实验方案可实现对RNAi的可控性实验。
研究目的
- 研究基因沉默对L1幼虫的影响。
- 了解daf-2基因在发育过程中的作用。
- 为研究人员提供详细的方法学方案。
使用的方法
- 制备含羧苄青霉素和IPTG的S基础培养基。
- 离心收集L1幼虫，用于后续实验。
- 在显微镜下计数幼虫，以实现精确给药。
- 接种靶向特定基因的RNAi细菌培养物。
主要结果
- 在受控条件下成功培养L1幼虫。
- 经RNAi处理后观察到有效的基因沉默效应。
- 处理后的幼虫中观察到表型变化。
- 该方案已得到验证，适用于未来基因功能研究。
结论
- RNAi 是研究 L1 幼虫中基因功能的有效方法。
- daf-2 基因对幼虫发育具有显著影响。
- 本方案可适用于其他感兴趣的基因。
常见问题
行业重要性概述
这种在液体培养基中进行的高通量RNAi饲喂方法可实现秀丽隐杆线虫（C. elegans）中基因敲降的规模化操作，支持早期发现阶段的靶点验证和表型筛选。通过突破基于培养板的通量限制，该方法提高了实验的可重复性以及对治疗靶点作用机制去风险化的预测可靠性。该技术使RNAi成为神经退行性疾病和衰老研究中先导化合物筛选流程中可扩展的工具。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过敲低 daf-2 基因，可研究其对线虫幼虫发育及衰老相关表型的影响，从而探究基因功能。
- 操作价值：相较于传统的平板喂养方法，采用液体培养处理更大规模的线虫群体，支持高通量筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：在受控的液体条件下，通过线虫计数和生长监测生成定量的表型读数。
- 操作价值：根据线虫数量采用与之成比例的体积化方案，标准化线虫给药和细菌RNAi递送。
转化与临床前研究
- 科学价值：提供了一种与疾病相关的系统，用于研究与长寿及代谢紊乱相关的胰岛素/IGF-1信号通路。
- 操作价值：通过可扩展的线虫培养体系，实现从靶点命中验证到机制性后续研究的连续性。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段的工作流程，可通过RNAi介导的基因沉默进行靶点验证，并利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）的表型评估推进至先导化合物的鉴定。
- 发现生物学：通过敲低 daf-2 以观察其对发育过程和蛋白质聚集表型的影响，促进假设验证。
- 筛选：通过标准化的线虫培养和RNAi细菌接种，提供可重复且定量的实验结果。
- 分析：在确定的培养条件下，通过幼虫计数和生长追踪实现对表型变化的定量检测。
- 转化研究：将 daf-2 的调控与衰老通路相联系，支持在以长寿为导向的发现研究中进行生物标志物的比对。
- 企业级复用：建立可重复使用的液体培养RNAi平台，适用于多个基因靶点及多轮筛选项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在遗传背景清晰的模式生物中实现稳定且可扩展的基因敲低，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的培养基制备、线虫计数和按比例添加RNAi细菌剂量，增强实验的可重复性。
- 战略价值：通过提高线虫处理通量和暴露均一性，减少靶点筛选中的假阴性结果，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：通过大规模液体培养实验生成可靠的表型数据，支持基于风险调整的靶点优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备秀丽隐杆线虫（C. elegans）操作、RNAi 技术以及液体培养维持方面的专业知识。
- 依赖摇床培养箱、费恩巴赫烧瓶（Fernbach flasks）以及用于幼虫计数和表型评估的显微镜。
- 为确保可重复性，需在不同实验团队间对线虫计数方案和RNAi细菌制备进行标准化。
- 当研究范围从daf-2基因扩展至其他不同遗传背景下的目标基因时，需考虑相应的实验条件优化。
- 高密度液体培养中存在实际限制，例如潜在的细菌过度生长以及氧气传质受限等问题。
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最后更新：29 八月 2026