液体培养物中的 RNAi 补料:一种敲低秀丽隐杆线虫基因表达的高通量方法

- 首先，添加羧苄青霉素和 1 毫摩尔 IPTG 以对照和测试含有 S 基础培养基的培养瓶。旋转含有生长阶段 1 级幼虫（也称为 L1 幼虫）的试管几分钟。现在去除上清液，将两微升 L1 放在琼脂平板上。将板放在解剖显微镜下并计数幼虫的数量。

将携带非特异性 RNAi 质粒的 RNAi 细菌添加到对照培养瓶中，将带有基因靶向 RNAi 的细菌添加到测试瓶中。添加的细菌量应与蠕虫的数量成正比。

让幼虫在不断摇晃下生长，以确保适当的氧合。幼虫以细菌为食。在幼虫内部，小干扰 RNA 与目标基因产生的互补 mRNA 结合并抑制蛋白质表达。最后，检查蠕虫以查找您感兴趣的表型。

在示例方案中，我们将在液体培养物中用靶向 daf-2 基因的 RNAi 处理 L1 幼虫。

- 开始处理时，按照随附文本方案中的说明，将 207.45 毫升 S 基础培养基和其他试剂添加到 2,800 毫升 Fernbach 培养瓶中。加入终浓度为 50 μg/mL 的羧青霉素和 1 mmolar 的 IPTG，并用膜螺帽关闭培养瓶。

从 25 摄氏度的培养箱中取出 L1 并将它们转移到 15 毫升试管中。将 L1 以 1,900 倍 g 离心 3 分钟。旋转后，去除上清液。在显微镜下，计算每 2 微升的 L1，并平均从至少 9 滴中获得的数字。

接下来，将 50,000 条蠕虫用于幼虫收集和 100,000 条蠕虫用于老化蠕虫收集，添加到上一步制备的四个 Fernbach 培养瓶中。然后，根据蠕虫的数量成比例地添加目标基因的对照 RNAi 细菌和 RNAi 细菌。

添加细菌后，用 S 基础完成蠕虫培养，使总体积达到 300 毫升。将蠕虫培养物在 25 摄氏度下在 150 RPM 的摇动培养箱中孵育，直至收集。