Name: 激光捕获显微切割技术的果蝇外周神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学习使用激光捕获显微切割技术从果蝇三龄幼虫中分离外周神经元，获取高质量RNA用于qRT-PCR和微阵列分析。该方法为神经发育与基因功能研究提供精准细胞分离方案。

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感谢 Yuh-Nung Jan 博士和 Wes Grueber 博士提供本研究中使用的果蝇品系，感谢 Virginia Espina、Emanuel Petricoin 博士和 Lance Liotta 博士在激光显微切割技术（LCM）方面的协助。作者感谢 Thomas F. 和 Kate Miller Jeffress 纪念信托基金对本研究的支持（D.N.C.），以及乔治梅森大学校长办公室（E.P.R.I.）的支持。

激光显微切割（LCM）的一般注意事项 果蝇 外周神经元
根据组织类型和所需细胞数量，激光显微切割（LCM）的时间可从6小时到一周甚至更长时间不等。
所有操作均在严格无RNA酶的条件下，按照标准流程进行。本实验使用了表达 21-7-GAL4,UAS-mCD8::GFP 或 ppk-GAL4,UAS-mCD8::GFP 转基因报告基因品系的幼虫。
1. 幼虫的准备
<ol>
 <li> 收集30-40只年龄相匹配的三龄幼虫，用ddH2O清洗，随后用RNAse Away（Sigma-Aldrich）短暂漂洗，最后再用ddH2O洗涤以去除残留的RNAse Away。在将幼虫包埋于OCT包埋剂之前，用洁净的Kimwipe纸彻底吸去多余的ddH2O。</li>
 <li> 取一个洁净的组织包埋模具，在其中铺上一层薄薄的OCT（厚度1.5-2 mm），足以覆盖单层幼虫即可。</li>
 <li> 在包埋幼虫前，如需要，可将含有OCT的包埋模具置于冰块上，使OCT冷却至0°C。此步骤有助于减少包埋过程中幼虫的移动。</li>
 <li> 将洁净的幼虫放置在预冷的OCT表面，并彼此平行排列。待幼虫排布完成后，缓慢加入OCT填充模具，注意避免扰动幼虫排列。将模具置于干冰上进行速冻。[关键步骤：需立即速冻幼虫，以减少其移动。] 该方法可使幼虫保持在同一平面上，从而最大化每张切片中可捕获的细胞数量。</li>
</ol>
如果需要保留组织形态以鉴定目的细胞，或发现每张切片中预期的细胞数量已足够，则直接进入第11步。
如果细胞已被特异性标记，并可通过易于识别的标记物（如 GFP 或 RFP）进行鉴定，但每张切片中的细胞数量较少，则步骤 5-10 可有助于增加每张切片可用于捕获的细胞数量。这些为可选步骤，仅在其他方法无法获得理想结果时，作为增加每张切片中可用于激光显微切割的 da 神经元数量的备选方案加以考虑。[注意：该方法可能破坏整体组织形态，导致基于特定空间位置的组织鉴定变得极为困难。]
<ol start="5">
 <li> 按照步骤1所述方法清洗50-70只三龄幼虫。将幼虫置于含有500 μl无RNA酶的1X PBS的1.5 ml微量离心管中。</li>
 <li> 使用聚丙烯研杵（USA Scientific），以6-7次缓慢而有力的研磨动作进行研磨。</li>
 <li> 将溶液在16,000 (x) g离心5-10秒（直至幼虫表皮沉降至微量离心管底部），弃去上清液。沉淀物主要应为紧密附着外周神经系统（包括da神经元）的幼虫表皮。</li>
 <li> 用1X PBS洗涤表皮沉淀物2-3次，并将沉淀重悬于500 μl 1X PBS中。在16,000 (x) g离心1分钟以形成致密沉淀。使用细口巴斯德吸管完全吸除上清液。</li>
 <li> 使用洁净的刮勺小心地将沉淀从微量离心管中取出，并用洁净的Kimwipe纸巾吸去多余的PBS。[注意：保持沉淀尽可能致密对于提高细胞得率至关重要]。将致密的表皮沉淀置于含有薄层OCT（约1 mm）的塑料模具中。</li>
 <li> 轻柔地将沉淀在模具内均匀铺展成薄层圆形区域。加满OCT包埋剂，并按照步骤4所述方法冷冻组织。</li>
 <li> 使用冷冻切片机在无涂层、有标记、不带电、无RNA酶的玻璃载玻片上切割5-8 μm厚的冷冻切片。[关键步骤：将组织切片置于载玻片中央附近位置。]</li>
 <li> 将载玻片直接保存在干冰上，或置于洁净的载玻片盒中于-80°C保存，直至进行显微切割。建议在切片后一周内完成激光显微切割（LCM）。</li>
</ol>
暂停点
2. 冷冻幼虫切片的脱水与角质层去除
[关键步骤：每次激光显微切割（LCM）实验前必须新鲜配制所有脱水溶液。冷冻幼虫组织切片的彻底脱水对于实现最佳显微切割效率至关重要]
<ol>
 <li> 从 -80°C 冰箱中取出含有冷冻幼虫组织切片的载玻片，并将其置于干冰上。</li>
 <li> 从干冰上取下一张载玻片，立即直接放入装有 70% 乙醇固定液的 50 ml 锥形管中，随后根据表 1 所示推荐时间用无 RNA 酶的 ddH2O 进行短暂漂洗。</li>
 <li> 冷冻切片中的幼虫角质层可能会影响捕获效率，因其会阻碍激光显微切割（LCM）帽与细胞之间的有效接触，从而导致非特异性捕获。如有必要，请执行以下步骤（4–5）以去除组织切片中的角质层。</li>
 <li> 用移液器轻轻将 50 μl 的 2.5% 胰蛋白酶直接滴加到组织切片上，在室温下孵育 5–30 秒。[关键步骤：此步骤可能需要优化。孵育时间取决于待显微切割的组织类型及切片厚度。孵育时间过长可能导致包括目标细胞在内的所有成分被清除，而时间过短则可能不足以去除角质层]</li>
 <li> 将载玻片在装有无 RNA 酶 ddH2O 的 50 ml 锥形管中短暂漂洗，以去除胰蛋白酶及松散附着的角质层碎片。</li>
 <li> 按照推荐时间（表 1）依次将载玻片浸入剩余的乙醇和二甲苯溶液中，完成脱水过程。</li>
 <li> 完成梯度脱水后，在进行激光显微切割（LCM）前，将载玻片在室温下用温和气流短暂吹干 60–120 秒。[注意：进行 LCM 前必须将组织切片中的二甲苯完全干燥。已知二甲苯可溶解 LCM 帽的聚合物，导致显微切割失败]</li>
</ol>
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>70% 乙醇（固定剂）</td>
 <td>3-10 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O</td>
 <td>5-10 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5% 胰蛋白酶孵育</td>
 <td>5-30 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O</td>
 <td>5-10 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% 乙醇</td>
 <td>60 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>95% 乙醇</td>
 <td>60 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% 乙醇</td>
 <td>120 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% 乙醇</td>
 <td>120 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% 二甲苯</td>
 <td>120 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% 二甲苯</td>
 <td>120 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>在温和气流中晾干</td>
 <td>60-120 秒</td>
 </tr>
</tbody>
</table> 
表1：冷冻幼虫组织切片激光捕获显微切割脱水的推荐步骤。
3. 激光显微切割
使用配备 Fluor 300 落射荧光光学系统（针对 EGFP 优化）的 PixCell IIe LCM 仪器进行激光显微切割操作。
[关键步骤：如有可能，应在湿度可控的环境中进行显微切割，以避免因湿度变化导致显微切割效率下降。环境湿度是影响显微切割效率的关键因素。低湿度环境会增加静电吸附，导致非特异性捕获；而高湿度则会降低显微切割效率。我们在相对湿度为25–50%的条件下获得了最佳的激光显微切割（LCM）效率。]
<ol>
 <li> 打开显微镜和激光控制箱的电源。</li>
 <li> 将HS LCM帽（Molecular Devices）装入CapSure帽架组件中：每次最多可装载两个LCM帽弹匣。</li>
 <li> 打开Molecular Devices软件，并输入实验信息，包括载玻片编号和帽批次号。</li>
 <li> 从弹匣中将一个新的HS LCM帽装入PixCell IIe LCM仪器，并根据操纵杆正确放置，以确保帽相对于捕获区域的准确定位。</li>
 <li> 将含有新鲜脱水的幼虫组织切片的显微镜载玻片放置在显微镜载物台上，用于显微切割。</li>
 <li> 使用目镜或计算机屏幕定位荧光标记的细胞。由于ppk-GAL4,UAS-mCD8::GFP转基因报告品系具有高度特异性，可通过GFP荧光轻松识别IV类da神经元。</li>
 <li> 使用CapSure HS LCM帽对组织进行激光显微切割[有关设置仪器、聚焦激光和执行LCM的详细操作步骤，请参见参考文献22]。</li>
 <li> 调整“功率”和“持续时间”激光脉冲参数，以获得精确的熔融聚合物斑点，其大小与所选激光斑点直径相对应。调节设置以自定义熔融聚合物区域的大小。以下参数用于单个IV类da神经元的显微切割：斑点直径7.5 μm，激光强度30–50 mW，激光时间2–4 ms，每个细胞1–2次脉冲。[关键步骤：获得合适斑点所需的激光参数可能因组织厚度和室内湿度条件而异。应调整“功率”和“持续时间”设置，以达到显微切割单个或多个细胞所需的熔融聚合物斑点大小。]</li>
 <li> 为最大限度提高特异性，应选择荧光强且重叠最少的细胞进行显微切割。每个帽可捕获多个细胞体。[关键步骤：为避免RNA降解，整个分析过程（包括脱水和显微切割）的总时间应控制在45分钟以内。]</li>
 <li> 所有目标细胞捕获完成后，取下带有显微切割细胞的HS LCM帽，将其放置在干净的载玻片上，以确认捕获细胞的存在，并目视检查帽上是否存在非目标细胞或碎片。</li>
</ol>
4. 来自激光显微切割细胞的 RNA 分离
<ol>
 <li> 将含有显微切割细胞的管盖连接到 ExtracSure（Molecular Devices）装置上。向含有细胞的管盖表面加入 12μl RNA 提取缓冲液（PicoPure，Molecular Devices），并将倒置的薄壁反应管（GeneAmp，Applied Biosystems）连接至 ExtracSure 装置。将组装好的装置置于对齐托盘（Molecular Devices）上，并用已在培养箱中预热至 42°C 的孵育块（Molecular Devices）覆盖。</li>
 <li> 经过 30 分钟孵育后，将含有提取物的管子在 800 ×g 条件下离心 2 分钟。关闭管盖，将细胞提取物储存在 -80°C，直至进行 RNA 纯化。</li>
</ol>
暂停点
<ol start="3">
 <li> 根据 PicoPure（Molecular Devices）RNA 提取试剂盒说明书提取 RNA 并进行柱纯化。DNA酶处理为可选步骤，可根据需要在柱上纯化过程中进行。如有需要，可在纯化过程中将多个 LCM 样本合并至同一根纯化柱中，以提高最终 RNA 产量，并用较小体积（11–30 μl）的洗脱缓冲液（PicoPure，Molecular Devices）洗脱，随后于 -80°C 保存直至使用。如需评估，可取 1 μl 洗脱液使用 Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies, Inc.）检测总 RNA 质量。</li>
</ol>
代表性结果
激光捕获显微切割（LCM）用于分离单个、类别特异性或多个 果蝇 三龄幼虫的da神经元（图1）。LCM技术能够在分离过程中实现高度的精确性和特异性 果蝇 da神经元细胞体（图2a-c）。此外，从这些分离的da神经元中纯化的总RNA质量极佳，Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, Inc.）分析显示清晰的5.8S、18S和28S核糖体RNA峰（图2d）。
为了评估分离细胞中神经元特异性的富集程度，我们采用神经元基因特异性标记物 elav 进行实时定量反转录 PCR（qRT-PCR）分析。在 qRT-PCR 分析中，我们计算了激光捕获显微切割（LCM）分离的 da 神经元中 elav 表达的相对水平，并使用 ΔΔCt 方法将其相对于内源性对照 (rp49) 进行归一化，同时以整个幼虫中提取的总 RNA 作为参照23。分析结果显示，与整个动物样本相比，LCM 显微切割的 da 神经元样本中 elav 的相对表达水平富集超过 2.5 倍（图 3）。
<img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig1.jpg" alt="使用层析和电泳方法的RNA提取流程图，显微镜分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：Drosophila 外周神经元的激光显微切割（LCM）。(a) 选择年龄匹配的三龄幼虫，清洗后 (b) 用OCT包埋并置于-80°C冷冻，(c) 使用标准冷冻切片机切出8μm连续组织切片，并 (d) 均匀贴附于洁净载玻片上。附着组织切片的载玻片在LCM处理前保存于-80°C。 (e,f) 在进行LCM前，将组织切片解冻，短暂用70%乙醇固定，随后用ddH2O快速漂洗。 (g) 将载玻片短暂与胰蛋白酶孵育，再用ddH2O漂洗，以去除幼虫切片中的角质层（黑色）。 (h,i) 去除幼虫角质层后的组织切片再经梯度乙醇脱水，最后用二甲苯透明。 (j) 将带有热敏性聚合物的LCM帽置于组织切片上，激光脉冲照射选定的荧光细胞体。激光脉冲使聚合物熔化并包裹目标细胞体。连同捕获细胞体的聚合物帽被提起后，(k) 向细胞中加入RNA提取缓冲液。捕获的细胞与RNA提取缓冲液在42°C孵育30分钟，之后可选择保存于-80°C，或直接进行RNA纯化处理。
<img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig2.jpg" alt="显微镜荧光原位杂交及RNA完整性电泳图结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2：激光显微切割（LCM）实现对da神经元的高精度捕获。（a） 进行LCM前经脱水和胰蛋白酶处理的8微米组织切片代表性图像，显示由ppk-GAL4,UASmCD8::GFP报告品系标记的两个IV型多树突（class-IV da）神经元，其中GFP荧光标记清晰可见。注意，其中一个神经元已被标出（箭头），用于后续捕获。（b） 被标出的神经元（箭头）胞体从组织切片中被干净且特异性地显微切割下来。（c） 捕获在LCM帽上的单个IV型多树突da神经元的端面视图。（d） 从LCM获取的da神经元中提取的总RNA经Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, Inc.）检测所得电泳图，显示优良的RNA质量，表现为清晰的5.8S、18S和28S核糖体RNA（rRNA）峰。 
<img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig3.jpg" alt="富集倍数柱状图；整体动物与激光显微切割捕获组织数据比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3：qRT-PCR显示，在激光显微切割捕获的da神经元中，神经元标志基因表达相对于整体动物显著富集。 对激光显微切割捕获的da神经元 (21-7-GAL4,UAS-mCD8::GFP) 及同龄三龄幼虫整体动物中的神经元特异性标志基因 (elav) 表达进行qRT-PCR分析，每组设三个重复。采用ΔΔCt法23，将激光显微切割捕获的da神经元中elav基因的相对表达水平以内源性对照(rp49)归一化，并相对于整体幼虫进行比较。结果显示，激光显微切割捕获的da神经元样本中elav的相对表达水平较整体动物提高2.5倍。
故障排除
问题：RNA降解或质量较低。
整个实验过程中确保无RNase环境。尽量将每张切片的激光显微切割（LCM）操作时间缩短至30分钟以内。除进行激光显微切割外，切片和样品均应置于干冰上保存。组织切片一旦切好，应避免反复冻融。
问题：在胰蛋白酶处理过程中（步骤 17-18），大多数细胞从载玻片上脱落。
尝试缩短胰蛋白酶处理时间。尝试降低胰蛋白酶浓度。
问题：帽状聚合物上存在角质层及其他非特异性组织碎片。
尝试用胶粘便签的粘性表面轻压聚合物表面，以去除组织碎片22。
问题：LCM 效率低。
尝试延长在100%乙醇和二甲苯中的孵育时间。使用除湿机降低室内湿度。

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<li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方案介绍了我们通过激光显微切割（LCM）分离 Drosophila 外周神经元的优化方法。尽管该LCM方案专为从三龄幼虫发育阶段特异性分离单个、类别特异或多个 Drosophila da神经元而设计，但对该方案进行轻微修改后，即可轻松适用于利用不同的 GAL4,UAS-mCD8-GFP 报告转基因标记并捕获各发育阶段的其他 Drosophila 细胞类型。我们的结果表明，通过激光显微切割获取的da神经元RNA质量极高，可直接用于qRT-PCR或基于微阵列的分析。该方案的应用不仅限于本文讨论的野生型目标细胞的捕获，还可将LCM与功能缺失（UAS-RNAi）和/或功能获得研究相结合，利用 GAL4/UAS 系统在特定细胞类型中开展研究。

<table><tbody><tr><td>10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td>稀释至1X工作液</td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>RNase-AWAY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯，组织学级</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>无RNA酶水</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP561-1</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度（OCT）包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA 提取试剂盒</td><td>Molecular Devices</td><td>KIT0204</td><td>遵循制造商说明&amp;rsquo;s 指令</td></tr><tr><td>带圆顶盖的薄壁反应管</td><td>应用生物系统公司</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>ExtracSure 样本提取装置</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM 0208</td><td></td></tr><tr><td>CapSure HS 胶帽样本提取用孵育块</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM0505</td><td></td></tr><tr><td>CapSure HS 激光显微切割帽和ExtracSure样本提取装置的对齐托盘</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM0504</td><td></td></tr><tr><td>CapSure HS LCM 帽盖</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM0213</td><td></td></tr><tr><td>75x100 毫米载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋模具</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9642669</td><td></td></tr><tr><td>适用于1.5 ml微量离心管的聚丙烯研磨杵</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇；95% 乙醇；100% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;设备：&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;李&gt;冷冻切片机&lt;/li&gt;&lt;李&gt;用于切片固定、冲洗、胰蛋白酶处理以及乙醇/二甲苯脱水的50 ml锥形管&lt;/li&gt;&lt;李&gt;-80&amp;#x00B0;C 冷冻室&lt;/li&gt;&lt;李&gt;培养箱&lt;/li&gt;&lt;李&gt;PixCell IIe LCM 显微切割系统，配备针对EGFP优化的Fluor 300落射荧光光学装置（Molecular Devices-Molecular Devices）&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

激光捕获显微切割 果蝇 外周神经元

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

果蝇外周神经系统（PNS）中的树突分支（da）神经元为研究特定类型树突形态发生的分子机制提供了一个极佳的模型系统1,2。为了促进对特定类型da神经元发育的分子分析，至关重要的是获得高纯度的此类细胞群体。尽管目前已存在多种针对果蝇细胞的细胞或组织特异性RNA分离技术，包括基于磁珠的细胞纯化3,4、荧光激活细胞分选（FACS）5-8以及基于RNA结合蛋白的策略9，但这些方法均难以实现对单个或多个特定类型的果蝇da神经元进行具有高空间精度的分离。激光显微切割（LCM）作为一种极为强大的工具，已可用于从组织切片中以高空间分辨率和准确性分离特定类型的细胞。从分离得到的细胞中提取的RNA，可进一步用于特定细胞类型的分析，包括qRT-PCR和微阵列表达谱分析10-16。迄今为止，LCM在果蝇组织和细胞分析中的应用仍较为有限17,18，包括对三龄幼虫发育阶段的da神经元的研究。 
在此，我们展示了优化的小胶质细胞分离方案 果蝇 使用红外（IR）类激光显微切割技术（LCM）分离da神经元。该方法可高特异性、高空间分辨率地捕获单个、特定类别或多个da神经元。选取表达相应标记物的同龄三龄幼虫进行实验。 UAS-mCD8::GFP19 由IV类da神经元特异性启动子调控的转基因 ppk-GAL420 驱动基因或 pan-da 神经元特异性 21-7-GAL421 驱动基因用于这些实验。从分离的da神经元中获得的RNA质量非常高，可直接用于后续应用，包括qRT-PCR或微阵列分析。此外，该LCM方案可轻松调整以捕获其他 果蝇 不同细胞类型在发育的各个阶段，依赖于细胞类型特异性 GAL4-GFP的驱动表达模式

在本视频文章中，我们介绍了一种利用红外捕获（IR）型激光显微切割技术（LCM）从三龄幼虫中分离单个或多个黑腹果蝇（Drosophila）da神经元的方法。从分离的神经元中获得的RNA可直接用于后续实验，包括定量逆转录PCR（qRT-PCR）或微阵列分析。

果蝇外周神经系统（PNS）中的树突分支（da）神经元为研究……提供了一个极佳的模型系统

激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection，LCM）已成为一种极为强大的工具，可用于以高空间分辨率和精确度从组织切片中分离特定细胞类型。此处利用LCM从三龄oph幼虫中分离周围神经元。将三龄幼虫包埋于冷冻模具中并进行冷冻，随后使用冷冻切片机切割连续的组织切片，将切片置于载玻片上，解冻后用70%乙醇固定。随后将载玻片与胰蛋白酶孵育，以去除残留的幼虫角质层，并通过乙醇梯度脱水及二甲苯透明处理。接着将激光显微切割帽置于组织切片上，利用脉冲激光捕获特定的荧光神经元细胞。最后，从捕获的细胞中提取RNA，用于后续应用，如定量逆转录PCR或微阵列分析。大家好，我是来自乔治梅森大学分子与微生物学系以及克拉索高级研究所的 Dan Cox。大家好，我是 Dan Cox 博士实验室的 Ish AER。今天我们将向您展示一种利用激光捕获显微切割技术，从单个或多个果蝇外周神经元中分离细胞并纯化 RNA 的实验方法。我们在实验室中采用此方法研究介导类别特异性DIN速率形态发生的分子机制。现在开始吧。本视频展示的所有操作均在严格无RNA酶的条件下，按照标准流程进行。开始本方案时，收集30至40只老龄三龄幼虫。用双蒸水清洗幼虫。用双蒸水短暂冲洗以去除RNA，然后再次用双蒸水洗涤一次。为彻底去除RNA，使用干净的Kim擦拭纸完全吸干多余的水分。接着，取一个干净的组织包埋模具，加入一层薄薄的OCT包埋剂。将模具置于冰块上，冷却至零摄氏度。使用镊子将清洁的幼虫和低温OCT包埋剂一同放入。OCT的低温有助于减少幼虫的活动。包埋过程中，将幼虫相互平行排列。幼虫排好后，缓慢向模具中加入OCT，注意不要扰动幼虫。接着速冻。将模具置于干冰上冷冻。这将确保幼虫沿单一平面排列，从而最大化每张切片可获得的细胞数量。使用冷冻切片机。在未带电荷且无RNase的普通载玻片上，将冷冻切片切成5至8微米厚度。将切片置于干冰上保存，随后转移至-80摄氏度冰箱，直至准备进行显微切割。所有用于脱水的溶液必须在每次激光显微切割（LCM）前新鲜配制。完全脱水冷冻的幼虫组织切片对于实现最佳显微切割效率至关重要。将装有冷冻幼虫组织切片的载玻片从负80摄氏度冰箱中取出，并置于干冰上。从载玻片盒中取出一张载玻片，并立即放入装有70%乙醇的50毫升锥形管中，浸泡3至10秒。然后将切片放入装有无RNAs酶的双蒸水的50毫升锥形管中冲洗5到10秒，以清除可能干扰激光显微切割（LCM）捕获的组织切片中的角质层。轻轻将50微升2.5%胰蛋白酶直接滴加到组织切片上，在室温下孵育5到30秒，随后将切片短暂浸入含有无RNAs酶的双蒸水的50毫升锥形管中，以去除胰蛋白酶及松散附着的角质层碎片。通过将切片依次浸入以下溶液中完成脱水过程。70%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇、100%二甲苯，最后再用一次100%二甲苯。脱水后，在室温下用温和的气流将载玻片完全吹干，时间为60至120秒。如果可能，应在湿度可控的环境中进行显微切割，以避免因湿度升高而导致效率下降。首先打开显微镜和激光控制盒的电源。将H-S-L-C-M帽装入帽架组件中的帽架内。每个帽可捕获多个细胞体。接下来，打开分子装置软件，输入实验详情，包括载玻片编号和帽批号。将带有幼虫组织切片的载玻片置于显微镜载物台上，进行显微切割。将新的 HS LCM 帽盖从弹夹加载到 P 细胞二 ELCM 仪器上，并根据操纵杆正确放置，以确保帽盖相对于捕获区域的准确定位；在 PPK GAL 四 U-A-S-M-C-D 八 GFP 或 21 7 G 四 UASM CD 八 GFP 转基因报告品系中定位荧光标记的细胞。外周神经系统中的树突状分支化神经元（DA 神经元）可通过 GFP 荧光轻松识别。为提高特异性，应选择荧光信号强且细胞重叠最少的细胞。接下来，调整激光脉冲的功率和持续时间参数，以形成精确熔化的聚合物斑点，其大小应与用于显微切割单类DA神经元的选定激光光斑尺寸相对应。推荐以下设置：光斑直径7.5微米，激光强度30至50毫瓦，激光时间2至4毫秒，每细胞照射1至2次。激光设置可能因组织类型、组织厚度和使用的显微切割帽类型而异。最终，需要通过实验测试确定最佳的捕获效果。接下来，对组织进行激光显微切割。在激光显微切割（LCM）过程中，将帽盖置于目标区域上方，并通过帽盖将低功率红外激光脉冲照射到目标细胞或细胞群上方的一层薄热敏聚合物膜上。当激光脉冲作用时，该膜软化，黏附于目标细胞，随后重新固化，使目标细胞牢固附着于膜上。当将盖片从组织切片上提起时，将目标细胞或细胞群从周围组织中显微切割下来，以捕获更多细胞至新的视野，并重复此过程。一旦完成目标细胞的捕获，取下激光显微切割（LCM）盖片，将其置于干净的载玻片上，以确认已捕获目标细胞且无非目标细胞或碎片污染。使用荧光和透射光照明对HS LCM盖片进行成像。 将含有显微切割细胞的管盖连接到提取装置上。然后向管盖表面加入12微升RNA提取缓冲液，并连接一个倒置的薄壁反应管，如图所示。将组件放置在对齐托盘上，并用预热的孵育块覆盖。然后将托盘放入42摄氏度的培养箱中孵育30分钟，孵育后进行离心。在800 × g 条件下离心2分钟，收集含有提取物的离心管。从离心机中取出离心管后，盖紧管盖，将细胞提取物于-80摄氏度保存，直至进行RNA提取纯化及柱纯化RNA。根据pico pure RNA提取试剂盒说明书，DNA处理是可选步骤，可根据需要在RNA纯化过程中进行柱上处理。RNA纯化后，应于-80摄氏度保存。采用激光捕获显微切割技术，从三龄幼虫中分离单一类别特异性或多种果蝇DA神经元。激光显微切割（LCM）可实现对果蝇D神经元胞体分离的高度精确性和特异性。图中显示的是经脱水和胰蛋白酶处理的8微米厚组织切片的代表性图像。在进行LCM之前，两类四型DA神经元已用GFP标记。箭头指示的是被选中用于捕获的神经元。该神经元的细胞体从组织切片中被高特异性地显微分离出来。图中显示了位于激光捕获显微切割帽上的一类四型多巴胺能神经元的内视图。从分离的多巴胺能神经元中纯化的总RNA质量极佳，Agilent 2100生物分析仪检测显示清晰的5.8S和28S核糖体RNA峰。采用实时定量反转录PCR检测神经元特异性基因标志物Lev，通过ΔΔCT法评估分离细胞的神经元特异性富集情况，结果显示，与整个动物组织相比，激光显微切割捕获的多巴胺能神经元中Lev水平富集超过2.5倍。我们刚刚向您展示了如何通过激光捕获显微切割技术从Joss或外周神经元中分离和纯化RNA。在进行该操作时，需要根据待显微切割组织的切片厚度，优化胰蛋白酶的浓度和消化时间。过长的孵育时间可能导致组织切片中目标细胞的丢失，而过短的孵育时间则可能不足以去除幼虫角质层，从而导致激光捕获显微切割效率低下。重要的是，所有组织脱水溶液必须新鲜配制。此外，为防止对激光显微切割（LCM）帽聚合物造成损伤，必须在进行LCM前将二甲苯完全蒸发。最后，为保持纯化细胞中RNA的完整性，在整个操作过程中必须严格维持RNA酶抑制条件。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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完整组织中的激光细胞消融 果蝇 幼虫揭示突触竞争

学习使用激光捕获显微切割技术从果蝇三龄幼虫中分离外周神经元，获取高质量RNA用于qRT-PCR和微阵列分析。该方法为神经发育与基因功能研究提供精准细胞分离方案。

激光捕获显微切割果蝇外周神经元

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