基于胚胎的化学毒性筛选：评估对发育中斑马鱼胚胎的影响

- 开始 由 添加 5 胚胎 在 E3 培养基 到 每个 良好 的 a 96孔 平板， 和 移除 的 过量 培养基 与 a 移液器 添加 E3 培养基 含有 卡那霉素 进入 每个 良好 到 防止 污染。 让 的 胚胎 生长 在 28 度 摄氏度

稀释 的 化合物 的 兴趣 与 一个 适当的 溶剂 如此 作为 DMSO 到 准备 若干 浓度 或 剂量， 和 测试 的 效应 的 每个 剂量 在 开发中 胚胎 一旦 的 胚胎 达到 的 期望的 阶段， 移液器 每个 储备液 溶液 进入 个体 孔 封面 的 培养皿 与 a 盖子 和 轻柔地 涡旋混合 它 到 混合 的 内容 让 的 胚胎 在 的 良好 培养皿 培养 在 28 度 摄氏度

在 的 期望的 时间 在 胚胎的 发育， 位置 的 良好 培养皿 下 a 合适的 显微镜 到 检查 的 胚胎 表型 你 可能 观察 表型 如此 作为 损失 的 眼睛, 延迟 生长， 或 损失 的 黑色素细胞 在 的 开发 胚胎 在 的 随后 方案 我们 将 测试 a 化合物 文库 用于 小 分子 抑制剂 的 前脑 发育

- 小 分子 文库 是 通常 提供 在 a 96孔 源 培养皿 与 每个 化合物 储存的 在 DMSO 作为 a 10 毫摩尔（mM） 储备液 关于 60 分钟 之前 的 胚胎 达到 的 期望的 阶段， 解冻 一个 适当的 数量 的 96孔 平板 含有 等分试样 的 小 分子 取 注意 的 的 连续的 或 其他 鉴定 数量 的 的 源 培养皿 为了 最小化 缩合 在 的 平板， 解冻 在 a 干燥 腔室 含有 干燥剂

短暂地 在配备多孔板适配器的台式离心机中离心 离心 这些 板 在 一个 台式 离心机 配备 有 一个 多孔 板 适配器的离心机中短暂离心。 移除 源板上的 铝密封膜 密封 胶带 从 该 源 板上 使用 一个 12通道 移液器 用DMSO将源板中的化合物稀释至所需浓度 将 化合物 在 该 源 板 中 至 所需 浓度 用 DMSO 在 本 方案中 我们 使用 一个 0.5 毫摩尔 最终 浓度 并 加入 4.75 微升 的 DMSO 以 稀释 该 10 毫摩尔 储备 板

当 的 胚胎 在 的 96孔 培养皿 达到 的 期望的 阶段， 使用 a 12通道 移液器 到 转移 2.5 微升 的 化合物 从 的 源 培养皿 进入 的 受体 平板 含有 的 胚胎 封面 的 培养皿 现在 含有 的 胚胎 和 化合物 与 盖子 和 记录 的 鉴定 数量 的 的 源 培养皿 开启 的 胚胎 培养皿 混合 的 平板 由 轻柔地 涡旋混合， 和 位置 他们 在 a 28.5 度 摄氏度 培养箱 封面 每个 源 培养皿 含有 未使用 小 分子 与 铝 密封 胶带 和 放置于 a 负 80 度 摄氏度 冷冻机 用于 长期 储存。

之前 至 执行 的 视觉 筛选， 制定 a 特异的 击中 标准 对于 例如， 在 a 屏幕 用于 小 分子 抑制剂 的 前脑 发育 a 命中 可能 是 a 化合物 那 赋予 的 损失 的 的 前脑 缺失 的 眼睛 是 一个 简单 视觉 指示剂 的 的 损失 的 前脑 和 需要 无 荧光 到 检测

在 期望的 次 在 发育 移除 的 96孔 平板 含有 化合物 处理 胚胎 从 的 培养箱 和 检查 每个 良好 在……下方 a 立体 显微镜 当 筛选 用于 小 分子 抑制剂 的 前脑 发育 检查 平板 在 28 小时 用于 损失 的 的 眼 作为 a 标记物 的 前脑 发育的 抑制 记录 的 身份 的 的 培养皿 和 良好 位置 用于 任何 良好 在 哪个 在 最少 3 出 的 5 胚胎 展示 的 规定的 命中 表型

放置 的 96孔 平板 返回 在 的 培养箱 重新确认 的 损失 的 眼睛 和 前脑 在 48 小时 即使 尽管 的 胚胎 将 不 有 a 前脑 他们 将 存活 至 在 最少 四 天。 重新确认 a 潜力 命中 由 重新检测 的 效应 的 的 化合物 在 若干 剂量。 对于 每个 剂量， 10 胚胎 是 测试 在 0.5 毫升 的 E3 培养基 在 a 48孔 培养皿 格式。

的 时间安排 的 化合物 加样 用于 重新检测 应该 是 相同的 到 那 的 的 原始 筛选 A 命中 是 已确认 当 的 诱导产生 表型 是 重现 在 a 剂量依赖性 方式 在 重新检测 的 的 化合物 最后， 识别 的 命中 化合物 从 的 数据库 的 小 分子 在 的 化学 图书馆