吗啉代注射：一种在斑马鱼中敲低目标基因表达以研究其功能的方法

- 一 方法 到 确定 的 功能 的 a 基因 是 到 敲除 向下 它的 表达 和 观察 的 效应。 Morpholino 寡聚体 是 经常 使用 在 基因敲低 研究 在 斑马鱼 A 吗啉代寡核苷酸 是 a 合成的 DNA样 分子 大约 25 碱基 长， 哪个 抑制 目标 基因 表达

进行 吗啉环寡核苷酸 处理时，将尾鳍部分截断并已麻醉的鱼置于注射板上， 放 一 条 鱼 在 一 个 部分 截断 的 尾 鳍 上 的 并 将 该 板 放 在 体 视显微镜下。 仅 向 背 侧 注 射 而 未 注 射 的 腹 侧 作为对照。 吗啉环寡核苷酸 可 根据 其 靶向 序列 以 两 种 方式 发 挥功能。 首先， 它们 结合 到 mRNA 上的 翻译 起始 位点 并 通 过 阻断 翻译 过 程 抑 制蛋白质合成。

第二， 它 能够 结合 到 的 内含子-外显子 连接 在 a 前体mRNA 和 防止 适当的 剪接 导致 在 a 有缺陷的 转录本 那 将 是 降解的 由 的 细胞 之后， 检查 的 尾侧 鳍 用于 生长 outgrowth 差异 介于 再生长 的 的 吗啉代寡核苷酸处理的 和 未处理 区域 表明 那 的 靶向的 蛋白 播放 a 角色 在 fin 再生 在 这个 方案 我们 将 使用 吗啉代寡核苷酸 作为 部分 的 a 尾侧 fin 再生 检测

- 的 天 之前 吗啉代寡核苷酸 注射， 制作 一个 注射 平板 与 2% 琼脂糖 那 具有 a 缺口 切割 出 在 一 结束 的 的 嗯， 哪个 将 帮助 稳定 的 鱼 用于 的 注射 步骤 仅 之前 注射， 稀释 的 荧光素标记的 吗啉寡核苷酸 在 RNA酶 和 DNA酶 自由 水 到 的 适当的 浓度 和 孵育 在 a 65 度 摄氏度 水 浴液 用于 五 分钟 加载 a 此前 制备完成 注射 针 和 切割 关闭 的 尖端 在 一个 角度。

接下来， 麻醉 的 鱼 和 位置 它 在 的 注射 平板 移除 全部 过量 液体 和 位置 的 板 在 的 阶段 的 a 立体 显微镜 定向 的 针 仅 远端 到 的 骨性 射线

插入 的 针 轻柔地 进入 的 再生的 组织 仅 远端 到 每个 骨性 射线 和 推 远端 直到 位于 在 的 芽基 当 的 针 是 正确地 局部的， 遵循 的 显微注射 系统 方向 和 注射 a 五 纳升 滴 的 的 吗啉代寡核苷酸 每 注射 随着 每个 注射， a 黄色 喷雾 的 吗啉代寡核苷酸 溶液 能 是 观察到， 哪个 有助于 定位 的 注射 至 的 芽基 工作 背侧 从 的 中线 注射 大约 75 纳升 的 吗啉代寡核苷酸 每 骨性 射线 在 的 背侧 侧面 离开 的 腹侧 侧面 作为 一个 仅电穿孔 对照组