分层琼脂糖封片法：为使用倒置显微镜进行长期成像制备活体斑马鱼胚胎 关键词：斑马鱼胚胎，活体成像，倒置显微镜，琼脂糖封片，长期观察，显微操作

- 开始 与 a 佩特里 培养皿 含有 胚胎 在 E3 培养基 添加 三卡因 到 麻醉 的 胚胎 和 苯硫脲, PTU 溶液, 到 抑制 色素 形成。 随着 的 帮助 的 a 解剖 显微镜, 脱绒毛膜 的 胚胎

使用 a 玻璃 移液器 到 转移 一 的 的 去卵膜的 胚胎 到 a 小 培养皿 培养皿 与 a 浅的 玻璃 底部 良好 在 的 中心 和 移除 的 过量 培养基 接下来， 位置 一个 琼脂糖 溶液 在 一个 最佳 浓度 到 最小化 胚胎 畸变 和 运动性 进入 a 微型离心机 管 和 热 它。 移至 向下 的 温度 到 30 度 摄氏度 到 避免 有害的 的 胚胎 由于 到 热

将 第 一 层 琼脂糖 铺 在 胚 胎 上 方，完全填满浅层孔穴。在孔穴上方覆盖另一块盖玻片，并在其上方加入 1% 琼脂糖。第二层用于固定盖玻片的位置。

一旦 的 琼脂糖 凝固， 填充 的 培养皿 培养皿 与 的 E3 培养基 含有 tricaine 这 是 的 第三 层 和 保持 的 琼脂糖 和 胚胎 水合的 在 的 随后 方案 我们 将 执行 分层的 琼脂 封片 的 斑马鱼 胚胎 用于 延长的 时间 间隔 成像

- 仅 之前 封片, 热 的 琼脂糖 溶液 到 65 度 摄氏度 和 然后 让 它 冷却 至 大约 30 度 摄氏度 因此 的 胚胎 是 不 有害的 由 的 热 和 添加 三卡因 到 的 琼脂糖 溶液 使用 35 毫米 玻璃 底部 培养皿 与 a 数量 零 覆盖 玻璃 底部 轻柔地 位置 a 去卵膜的 胚胎 与 一 的 它的 侧向 侧面 朝向 的 底部 的 的 培养皿 与 a 玻璃 移液器 或 a 微量移液器 然后 仔细地 移除 任何 剩余 E3 与 a 微量移液器

添加 的 首先 琼脂糖 溶液 到 的 小 良好 创建 由 的 覆盖 玻璃 已附上 到 的 底部 的 的 培养皿 到 盖子 的 胚胎 制作 当然 那 的 琼脂糖 盖子 的 小 良好 但 是否 不 溢出 它。 封面 的 小 良好 与 的 盖子 玻璃 到 创建 a 狭窄 琼脂糖填充的 空间 与 的 胚胎 之间 的 二 盖子 眼镜 放置 a 层 的 1% 琼脂糖 溶液 在 顶部 的 的 盖子 玻璃 全部 结束 的 底部 的 的 培养皿， 哪一个 将 保持 的 盖子 玻璃 在 位置 作为 它 凝固。 然后 填充 的 剩余 部分 的 的 培养皿 与 E3 含有 0.02% 三卡因 到 保持 的 系统 水合的 至 识别 的 最佳的 琼脂糖 浓度 用于 层 一， 安装 的 胚胎 在 增加 浓度 的 琼脂糖 和 执行 延时 成像 到 识别 的 浓度 那 最小化 胚胎 畸变 和 运动性 然后 测试 a 更细的 范围 的 浓度 基于 开启 的 结果。

- 该 大多数 关键的 步骤 的 这 实验方案 是 到 识别 的 最佳的 浓度 的 琼脂糖 用于 层 一 测试 不同 纳米 浓度 的 琼脂糖 如此 作为 0.030%, 0.032%, 和 等等， 到 找到 的 最佳的 浓度