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- 将感兴趣的胚胎放入苯硫脲、PTU、林格氏液中，以抑制色素形成，受精后 24 小时开始。这使得显影的解剖结构更加明显，这对于此过程是必需的。将三卡因麻醉胚胎转移到成像室中。将载玻片放在顶部并在显微镜下观察。专注于要受伤的轴突，这在 488 纳米激光下可见，因为它转基因表达 GFP。
拍摄网站的 before image。接下来，用 910 纳米激光观察轴突，使 GFP 发出红色荧光。增加该激光的强度以伤害目标区域，而不影响周围组织。这个过程称为轴索切开术。用第一台激光拍摄新图像以确认轴索切断术，轴索切开术表现为散落的碎片。在以下协议中，我们将使用双光子激光对斑马鱼胚胎中的外周感觉轴突进行轴切术。
- 如果您的实验室没有定制的双光子示波器，也可以使用蔡司 510 共聚焦双光子显微镜来切断轴突。我们首先将安装好的胚胎放在载物台上，并使用 25 倍水物镜将其聚焦。接下来，在多轨设置中打开两个光子和氩激光器，以便可以从一个激光器切换到另一个激光器。
虽然两种激光器都用于检测 GFP，但为了区分两者，两个光子发射用红色可视化，氩激光发射用绿色可视化。使用氩激光识别要受伤的轴突。在 Z 设置下，标记第一个和最后一个光学切片，拍摄共聚焦图像，并创建 Z 堆栈的最大投影。
关闭氩激光器并打开双光子激光器。以大约 9% 的透射强度进行扫描，以确保轴突仍然清晰对焦。点击 Stop 停止 按钮，以便 裁剪 工具将可用。使用 Crop 放大感兴趣的区域。通常我们放大到 70 倍左右。选择要受伤的轴突区域，并将该区域聚焦。可以在 模式 标签。
接下来，在 Channels 选项卡下，将两个光子的强度从大约 9% 的透射更改为 15% 到 30% 的透射。要激活新设置，请单击 Fast XY 按钮，然后单击 Stop 停止 之后快速以避免过度损坏。如果手术有效，轴突应被视为分散的碎片。最后，为了确保轴突确实受损，请切换回 488 纳米氩激光器。拍摄另一个共聚焦图像并创建 Z 堆栈的最大投影。
