双光子激光轴突切割：一种在斑马鱼胚胎中损伤轴突并观察轴突修复的方法

- 放置 胚胎 的 兴趣 进入 苯基 硫脲， PTU 林格氏液 溶液 到 抑制 色素 形成 哪一个 开始 在 24 小时 术后 受精 这 使得 的 开发 解剖学 更多 可见的 哪个 是 必要 用于 这 步骤 转移 a 三卡因 麻醉的 胚胎 进入 一个 成像 腔室 放置 a 玻璃 载玻片 在 顶部 和 查看 它 在……下方 你的 显微镜 聚焦 开启 的 轴突 到 是 受伤的， 其 是 可见的 下 a 488 纳米 激光 因为 它 转基因地 表达 GFP

取 a 之前 图像 的 的 位点。 接下来， 查看 的 轴突 与 a 910 纳米 激光 哪个 原因 的 GFP 到 荧光 红色 增加 的 强度 的 这 激光 到 损伤 的 目标 面积 无 影响 的 周围 组织 这 过程 是 称为 轴突切断术 取 a 新的 图像 与 的 首先 激光 到 确认 的 轴突切断术， 哪个 出现 作为 散在的 碎片 在 的 随后 方案， 我们 将 执行 一个 轴突切断术 的 外周 感觉 轴突 在 斑马鱼 胚胎 使用 a 双光子 激光

- 如果 a 定制 构建 双光子 显微镜 是 不 可获取的 在 你的 实验室， 的 Zeiss 510 共聚焦 双光子 显微镜 能 也 是 使用 到 切断 轴突。 我们 开始 由 放置 的 安装 胚胎 到……上 的 阶段 和 带来 它 进入 焦点 使用 a 25x 水 目的。 接下来， 翻转 开启 的 二 光子和 氩 激光器 在 a 多轨道 设置 因此 那 它 是 可能的 到 开关 从 一 到 的 其他。

尽管 两者 激光器 是 使用 到 检测 GFP, 的 二 光子 发射 是 可视化 与 红色 和 的 氩 激光 发射 与 绿色 在 顺序 至 分化 的 二 使用 的 氩 激光 到 识别 一个 轴突 到 损伤。 下 Z 设置 标记 的 首先 和 最后 光学 切片， 取 a 共聚焦 图像 和 创建 a 最大值 投射 的 的 Z 轴扫描

转动 关闭 的 氩 激光 和 转动 开启 的 二 光子 激光 扫描 在 一个 强度 的 关于 9% 透射 到 制作 当然 那 的 轴突 是 仍然 在 焦点 点击 的 停止 按钮 因此 那 的 作物 工具 将 是 可用。 使用 作物 到 缩放 在 在 的 面积 的 兴趣。 通常 我们 缩放 到 关于 70x 选择 的 区域 的 的 轴突 到 是 受伤的 和 带来 这 区域 进入 焦点 这 放大 能 是 已检查 在……下方 的 模式 表。

接下来， 在……下方 的 通道 标签, 改变 的 强度 的 的 二 光子 从 关于 9% 透射 至 15% 到 30% 传播 至 激活 的 新 设置， 点击 开启 的 快速 XY 按钮 和 然后 点击 停止 迅速地 随后 到 避免 过量 损伤。 的 轴突 应该 是 观察到 作为 散在的 碎片 如果 的 实验步骤 有效。 最后， 至 确保 那 的 轴突 是 确实 受损的， 开关 返回 到 的 488 纳米 氩 激光 取 另一个 共聚焦 图像 和 创建 a 最大值 投射 的 的 Z 堆栈