胚胎显微注射：一种将化合物递送至斑马鱼卵黄的技术

- 放置 二 女性 和 二 雄性 鱼 进入 a 分割 繁殖 储液罐 一 夜晚 之前 的 注射 的 随后 早上好， 移除 的 分隔器 和 让 的 鱼 品种 直到 你 观察 卵 在 的 底部 的 的 罐 收集 的 卵 和 洗涤 他们 与 E3 培养基 含有 亚甲基 蓝色 a 杀菌剂 观察 的 卵 在……下方 a 显微镜 和 移除 未受精的 卵。 未受精 卵 有 a 清晰 卵黄 膜， 而 受精的 卵 有 a 暗 卵黄 膜

保持 10 胚胎 在 a 分离 佩特里 培养皿 作为 未注射 对照组 使用 a 转移 移液器 对齐 的 胚胎 进入 的 槽 的 a 显微注射 培养皿 在 室 温度 和 位置 它 下 这 显微镜 轻柔地 推 的 显微注射 针 通过 的 绒毛膜 进入 的 卵黄 和 缓慢地 注射 a 化合物 的 兴趣 含有 a 标记物 如此 作为 苯酚 红色 细胞质的 流 允许 的 化合物 到 弥散 进入 的 胚胎的 细胞

之后 注射， 培养 的 胚胎 在 E3 培养基 与 亚甲基 蓝色 在 28 度 摄氏度 保持 检查 的 健康 的 的 胚胎 移除 任何 死亡的 或 异常地 开发中 胚胎 和 改变 的 培养基 每日 在 的 随后 方案， 我们 将 使用 显微注射 到 递送 a 核糖核蛋白复合物， 或 RNP 复合物， 进入 斑马鱼 胚胎

- 首先， 准备 的 斑马鱼 受试者 用于 繁殖 的 夜晚 之前 到 执行 注射 作为 描述 在 的 text 实验方案 然后 结合 Cas9 蛋白 和 sgRNA 在 a 二比一 比率。 孵育 的 溶液 在 房间 温度 用于 五 分钟 而 的 Cas9 和 sgRNA 表单 a 核糖核蛋白 复合物 然后 添加 0.5 微升 的 2.5% 苯酚 红色 溶液 足够 RNase 自由 水 到 实现 a 最终 体积 的 五 微升

至 准备 的 注射 针， 使用 a 微量移液器 拉制仪 到 拉 a 1毫米 玻璃 毛细管 然后 切割 的 尖端 的 的 导致 玻璃 针 与 a 剃刀 刀片 至 获得 一个 倾斜的 开口 放置 的 针 在 a 显微操作仪 附着 到 a 显微注射仪 使用 a 光 显微镜, 调节 的 注射 压力 直到 的 针 始终如一地 注射 一 纳升 的 溶液 在 的 佩特里 培养皿

- 之前 执行 胚胎 显微注射 练习 准备 针 和 注射 对照 胚胎 使用 a 仅染料 溶液 和 记录 的 存活率 之后 24 小时 的 发育 你 应该 是 能够 到 获得 更大 比 90% 存活率 相比 到 一个 未注射 对照

- 接下来， 选择 10 到 15 胚胎 作为 a 对照 种群 和 位置 它们 在 a 分离 标记的 佩特里 培养皿 使用 a 转移 移液器 仔细地 线 的 剩余部分 胚胎 向上 在 a 室温 注射 平板 下 a 解剖 显微镜, 注射 一 纳升 的 的 溶液 进入 的 卵黄 囊 的 每个 胚胎 然后 返回 的 注射 胚胎 到 a 标记的 佩特里 培养皿 和 盖子 他们 与 1X E3 培养基 与 亚甲基 蓝色 放置 的 注射 胚胎 在 一个 培养箱 在 28 度 摄氏度 用于 24 小时 然后 检查 的 注射 胚胎 到 移除 死亡 或 异常地 开发中 个体