三维共培养与直接相互作用：癌细胞与单核细胞共培养以研究其相互作用

首先，将 DQ 胶原蛋白 IV（一种荧光染料淬灭的蛋白底物）加入细胞外基质提取物（ECME）中。将该提取物加入双孔载玻片的每个孔中。将第一孔标记为共培养组，第二孔标记为对照组。向各孔中加入适量的荧光标记癌细胞悬液，并在 37 摄氏度下孵育载玻片，孵育时间根据实验需求而定，以促进细胞贴附。

向第一孔中加入所需量的单核细胞悬液。在37摄氏度下使ECME凝固。将等比例的癌细胞和单核细胞培养基加入各孔中，并将载玻片置于二氧化碳环境中，在37摄氏度下孵育所需时间。在共培养孔中，癌细胞分泌单核细胞趋化蛋白等蛋白质以吸引单核细胞。

相比之下，单核细胞会产生基质金属蛋白酶（MMP）来降解胶原蛋白，从而促进癌细胞的侵袭。在共聚焦显微镜下观察载玻片，DQ标记的胶原蛋白降解后会发出荧光，在共培养细胞中荧光信号更强，表明存在细胞间相互作用，而在对照细胞中信号较弱。在接下来的实验方案中，我们将乳腺癌细胞与单核细胞进行共培养，以研究它们之间的相互作用。

在细胞培养前，使用市售的香豆素和罗丹明对BRC细胞和单核细胞进行标记时，先制备含有2 × 10⁶个目标BRC细胞的单层细胞，然后将标准培养基替换为足量预热的荧光染料工作液。在37°C、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育30分钟。随后吸除染料溶液，并用足量的1× PBS 轻柔冲洗细胞。

吸去 PBS，加入标准培养基。消化细胞时，向培养瓶中加入 2 毫升 0.05% 胰蛋白酶和 0.48 毫摩尔/升 EDTA，于 37 °C 培养 5 至 10 分钟。加入 200 微升 FBS 以终止胰蛋白酶消化，并加入 7 毫升不含添加剂的相应培养基。

用移液器吹打重悬细胞，然后取10微升细胞悬液转移至血细胞计数板中进行计数。接着，在室温下以430 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，加入数毫升预热的荧光染料工作液重悬细胞。

将细胞悬液在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育30分钟。再次离心收集细胞后，弃去染料工作液，加入5至7毫升1×磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻重悬细胞。再次离心收集细胞并弃去PBS后，用5至7毫升标准培养基重悬细胞。

取10微升细胞悬液进行计数。在四孔板系统的每个孔底部加入足量ECME，使其形成均匀的一层，以建立共培养体系。每孔接种20微升单细胞悬液，其中含有5×10⁵个标记的BRC细胞。在37°C孵育15至20分钟后，加入80微升含2.5×10⁵个标记单核细胞的悬液，培养基为添加了60% ECME的检测培养基。

将ECME在37摄氏度下静置15至20分钟，使其凝固。随后，加入1毫升BRC细胞与单核细胞培养基按1:1比例混合的培养液。将共培养体系置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中培养24小时、48小时或5天，以追踪不同时间点的变化。

为了降解细胞外基质蛋白并从培养物中回收细胞，先吸除并弃去培养基，然后向培养物中加入0.5毫