Name: 原位大鼠后肢移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-12T17:40:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: 学习原位大鼠后肢移植技术，采用袖套法血管吻合进行复合组织同种异体移植研究。该方法用于探究缺血再灌注损伤及免疫排斥反应机制，为减少免疫抑制治疗提供实验模型。

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供体手术与后肢取材
<ol>
<li>	手术过程中使用一套无菌的显微外科器械。术者应穿戴适当的手术服装，包括无菌手套，并在手术开始前更换手套。</li>
<li>	通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg，IP）对大鼠进行麻醉，并将其仰卧位置于加热的手术区域上，以在整个手术过程中维持稳定的动物体温。</li>
<li>	在皮肤切口前，手术区域需分别使用消毒剂和酒精各消毒三次。为防止动物角膜干燥，术前应使用眼用软膏（Vidisic）润滑眼睛。</li>
<li>	在右侧腹股沟区腹股沟韧带水平做一皮肤切口。使用双极电凝和钝性分离游离股动静脉；深部分支以8-0丝线结扎。</li>
<li>	通过阴茎静脉注射300 μl（50 IU）肝素以实现抗凝。</li>
<li>	在腹股沟韧带水平结扎股动静脉，并在结扎远端切断血管。</li>
<li>	通过股动脉在5分钟内灌注5 ml冰冻（4°C）HTK溶液至后肢，以冲洗肌肉组织。</li>
<li>	使用剪刀锐性分离所有肌群，并在股骨远端三分之一处使用电动旋转锯进行截骨。</li>
<li>	取下的肢体随即浸入20 mL冰冻HTK溶液中，用于保存和低温储存，直至移植使用。</li>
</ol>
受体手术与移植
<ol>
<li> 大鼠通过腹腔注射戊巴比妥麻醉后，仰卧位置于手术区域。</li>
<li> 在右侧腹股沟区腹股沟韧带水平做一皮肤切口。使用双极电凝和钝性分离法游离股动静脉。</li>
<li> 尽可能远端结扎股动静脉，但需位于腹壁下血管分支部位近端。在腹股沟韧带水平的动脉和静脉上放置血管夹。</li>
<li> 将聚乙烯套管套入股动脉（套管内径：0.912 mm，管壁厚度：0.010 mm，套管长度：2.0 mm）和股静脉（套管内径：1.151 mm；管壁厚度：0.010 mm，套管长度：2.0 mm）。用血管扩张器牵拉血管腔边缘，将股动脉和股静脉完全翻转覆盖于套管整个表面（约2 mm），并用一圈8-0丝线结扎固定。</li>
<li> 为留出供体肢体空间，通过锐性分离肌肉群并在股骨中段行截骨术，切除受体肢体。</li>
<li> 将供体肢体从HTK溶液中取出，移植手术开始，使用18号针头（长度：1.5–2.0 cm）作为髓内钉进行股骨的骨固定。</li>
<li> 使用4-0 Vicryl或Prolene间断缝线紧密对合腹侧肌群。</li>
<li> 血管吻合通过将供体静脉和动脉翻转套接至受体静脉及套管复合体上完成。再次使用一圈8-0丝线结扎以固定吻合口。</li>
<li> 先松开静脉夹，随后松开动脉夹，通过远端肢体和足部颜色恢复以及动脉搏动性血流的出现来观察再灌注情况。</li>
<li> 使用4-0 Vicryl或Prolene间断缝线重新对合剩余的背侧肌群。</li>
<li> 皮肤使用4-0 Vicryl或Prolene间断缝线缝合关闭。</li>
<li> 将受体大鼠置于加热垫上，并密切监测直至苏醒。</li>
<li> 受体动物在移植后三天内接受预防性抗生素（头孢唑林，20 mg/天，肌内注射）和布托啡诺（Buprenex，0.1 mg/kg，皮下注射）。</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, R. I., Cerra, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+reimplantation+and+transplantation+of+a+complex+organ%3A+the+rat+hind+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb.</a> J Surg Res. 24 (6), 501-506 (1978).</li>
<li>Petruzzo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+international+registry+on+hand+and+composite+tissue+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The international registry on hand and composite tissue transplantation.</a> Transplantation. 86 (4), 487-492 (2008).</li>
<li>Schneeberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+forearm+transplantation%3A+outcome+at+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">First forearm transplantation: outcome at 3 years.</a> Am J Transplant. 7 (7), 1753-1762 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

数十年的实验研究为近年来人类手部移植的成功奠定了基础。1978年，Shapiro等人建立了大鼠原位后肢移植模型，非常适合研究复合组织移植物的各种病理、生理和免疫学特征及其功能结果。我们通过引入一种无缝合套管技术，改进了该手术中最具挑战性的部分——血管吻合。与传统的缝合技术相比，该技术简化并缩短了手术过程，使具备基本显微外科经验的外科医生也能以较高的存活率（80–90%）完成该手术。

由于无需进行缝合吻合，从而降低了出血、血栓形成以及血管蒂扭曲的风险。然而，套管技术存在新的潜在风险，即血液最初与套管内腔接触部位可能出现狭窄或湍流，但通过选择合适尺寸的套管可将此风险降至最低。此外，套管吻合可轻松应对较小的管径差异，进一步减少了对不同直径血管进行缝合所带来的固有风险。以下列出了成功实施套管吻合时需考虑的一些最重要因素：
<ol>
<li>	戊巴比妥单次注射（50 mg/kg，腹腔内）应足以使动物麻醉90分钟。若手术持续时间超过70-80分钟，应追加15 mg/kg（腹腔内）剂量。麻醉深度可通过术中重复脚趾夹捏反射试验进行检测。</li>
<li>	供体后肢/受体后肢的截骨...

<table><tbody><tr><td>戊巴比妥钠&amp;#174;</td><td>OVATION Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肝素免疫剂</td><td>Ebewe Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Custodiol HTK 灌注保存液</td><td>Essential Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外膜剪</td><td>ASSI</td><td>ASSI&amp;#174;SAS-21 R-8T</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>ASSI</td><td>ASSI&amp;#174;JFC-7</td><td></td></tr><tr><td>扩张镊</td><td>ASSI</td><td>ASSI&amp;#174;D-5AZ</td><td></td></tr><tr><td>聚酰亚胺管</td><td>River Tech Medical</td><td>#17; #19</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠原位下肢移植

Orthotopic Hind-Limb Transplantation in Rats

复合组织异体移植（CTA）在手部、前臂或手指缺失后已成为一种有效的治疗选择，并已成为重建外科领域的一种新型治疗手段。然而，为确保移植物存活，需要长期大剂量联合使用多种免疫抑制药物，这可能带来严重副作用，从而限制了其广泛应用。该领域的进一步发展可能依赖于对复合组织移植物中基础免疫学机制及缺血再灌注损伤的更深入理解。
迄今为止，大鼠原位后肢移植一直是重建性移植（RT）首选的啮齿类动物模型，然而该手术操作极为复杂，需要高超的显微外科技术以重新连接血管、骨骼、肌肉和神经。
我们已将血管套接吻合技术引入该模型，为大鼠后肢移植提供了一种快速且可靠的手术方法。该技术简化并缩短了手术过程，使具备基本显微外科经验的外科医生能够成功完成手术，并实现较高的存活率和较低的并发症发生率。该技术似乎非常适用于免疫学以及缺血再灌注损伤（IRI）的研究。

此处我们介绍正位大鼠后肢移植手术步骤，该方法似乎是目前的金标准 体内 复合组织异体移植研究模型

复合组织异体移植（CTA）在手、前臂或手指缺失后现已成为一种有效的治疗选择，并已发展为一种新型……

我是来自因斯布鲁克医科大学内脏移植与胸外科系丹尼尔斯·罗斯基研究实验室的Robert Suha。今天我们将向您展示红色小鼠肢体移植手术的操作过程，并介绍一种用于再血管化的套管技术。该肢体移植手术由我们外科住院医师团队完成，其中包括我本人。我们利用该动物模型研究复合组织异体移植中与缺血-再灌注相关的损伤。此外，我们还通过该手术模型研究复合组织异体移植排斥的免疫学事件，以及预防排斥反应发生的策略。这些策略包括通过采用靶向性免疫调节方案，实现维持性免疫抑制剂的减量甚至完全避免使用。红色后肢移植手术首先从获取供体复合组织移植物开始，即将供体大鼠的右侧后肢切除并置于冰上保存。接着，将受体大鼠的右侧后肢切除，以腾出空间用于植入供体肢体。随后，将供体肢体从冰上取出，并移植到受体大鼠体内。在此模型中，采用套管技术进行血管吻合。在我们的实验中，使用了体重为250克的雄性Louis大鼠。通过腹腔注射戊巴比妥钠50毫克/千克来诱导麻醉。对麻醉后的红色区域进行剃毛和消毒，范围包括腹股沟及周围组织，以备手术。需要一套完整的显微外科器械，包括直头显微外科剪、血管扩张器和两把弯头镊子。此外，最重要的器械是此处所示的显微外科血管夹。为了检测麻醉深度，采用足趾夹捏反射进行测试。将大鼠置于无菌平台上，并固定其四肢，使其完全伸展，然后进行切口。为防止污染，需将肢体上的任何轴向物质清除干净。在右侧腹股沟区，于腹股沟韧带水平做一横切口。股动静脉紧位于皮肤下方，使用双极镊和钝性分离法将其游离。随后游离腹壁下血管并予以电凝切断。在分离后，于静脉和动脉周围置入单环牵引缝线，以便在不直接使用器械接触血管的情况下进行牵拉。动脉和静脉的深部分支近端以8-0丝线结扎，远端则电凝处理，随后采集供体肢体。通过阴茎静脉给予50单位肝素。一分钟后，将注意力重新回到股血管。使用8-0丝线尽可能准确地结扎股动脉，并对股静脉（Fal）重复相同操作。随后，从结扎处远端切断两条血管，并通过动脉用肝素化的冰冻HDK溶液灌注后肢，持续五分钟。接下来，用剪刀仔细分离所有肌群。在股骨远端三分之一处，使用旋转电动锯进行截骨。获取的肢体随即浸入20毫升冰冻的HDK溶液中，以进行保存和低温储存，直至移植。受体手术的开始步骤与供体手术类似，首先分离并解剖股动静脉。在仔细解剖后，使用8-0丝线在尽可能远的位置结扎血管，但需位于腹壁浅动静脉分支的近端。随后，通过将多边形套管拉过血管，完成受体静脉的套管安装。在静脉套管近端的静脉及套管手柄处放置单支静脉钳，以确保完全止血。剪断静脉远端的结扎线，将静脉翻转覆盖于套管上。用一根8字形结扎线在血管周围作环形结扎，固定套管，使受体静脉就位。对带有较小直径袖套的动脉执行完全相同的步骤。受体的下肢以与供体下肢类似的方式进行解剖，通过锐性分离肌肉群，并在股骨中段进行截骨术。现在我们已准备好移植后肢。将供体肢体从HDK溶液中取出。移植手术开始时，使用18号针头作为髓内钉进行股骨的骨吻合。剪去针尖，将剩余针头截成一厘米半至两厘米长。使用4针间断的Vicryl或Proline缝线将腹侧肌群紧密对合，以稳定肢体并为血管吻合做准备。对于套管法吻合，将供体静脉扩张后套过受体静脉及套管，并用另一圈8针缝线环扎固定。供体动脉采用相同的手术步骤。最后，当两个血管均处于稳定状态后，先松开静脉血管夹，随后松开动脉血管夹。再灌注会立即发生，可通过远端肢体和足部颜色的恢复以及动脉内搏动性血流的出现而直观观察到。然后重新对合剩余的背侧肌群。皮肤使用4-0 Vicryl或Proline间断缝合关闭，移植手术至此完成。术后将小鼠置于加热垫上保温，并给予镇痛药和抗生素。术后密切观察小鼠48至72小时，监测有无痛苦迹象或手术并发症。套管技术在吻合术中的应用在过去几十年中已广泛用于不同的外科研究领域，从海洋生物肾脏移植模型到异位心脏移植模型均有涉及。该技术可用于研究缺血-再灌注相关损伤的各个方面以及免疫学现象。在完成移植手术后。本文展示了这种独特套管技术在肢体复合组织移植中的首次应用。在小型动物模型中，与传统的缝合吻合技术相比，套管技术显著缩短了手术时间，降低了操作者所需的显微外科技术要求，并减少了术中失血量。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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