机械解离:一种从组织中获得活细胞的方法

首先，称量组织碎片并测量其长度、宽度和高度。将组织放入装有培养基的培养皿中，然后用手术刀将其切成小块。将所有物质转移到 C 管中，使用巴斯德移液器进行均质化。

将试管放入机械分离器中，并根据需要运行循环。该装置利用机械力从组织样本中提取活的单细胞，同时保持细胞完整性，包括表面蛋白。通过固定在离心管上的细胞过滤器倒出匀浆。

重新匀浆剩余的组织，并通过细胞过滤器将匀浆过滤到试管中。离心匀浆并去除上清液。现在，将细胞沉淀重悬于培养基中，并将少量细胞悬液转移到含有台盼蓝染色剂的试管中。

染色后，将细胞转移到血细胞计数器载玻片上。计数透明的活细胞。死细胞吸收了染色剂，因为它们的细胞膜不完整。在以下方案中，我们将对新鲜人体组织进行非酶解离，用于 CD45 + 细胞的定量和定性分析。

- 首先称量组织样本，然后测量组织的长度、宽度和高度。然后将组织片段转移到含有 1 毫升适当的化学成分明确、无血清造血细胞培养基的小培养皿中，并使用无菌手术刀将样品切成 1 至 2 平方毫米的小块。接下来，将培养皿内容物转移到机械解离器 C 管中，并用 2 毫升培养基冲洗培养皿和手术刀。

将洗涤液加入 C 管中，然后连续运行 8.01 机械解离器程序两次，以轻轻地将组织片段匀浆成单细胞悬液。第二个循环后，通过 40 微米的细胞过滤器将匀浆倒入 50 毫升锥形管中。然后使用洗涤培养皿中的相同巴斯德移液管将 C 管中残留的任何液体转移到细胞过滤器中。

接下来，使用 1 毫升微量移液器将过滤后的液体转移到 15 毫升锥形管中，然后用另外 3 毫升培养基冲洗 C 管。通过细胞过滤器将洗涤液转移到 50 mL 试管中。然后用干净的 1 毫升吸头轻轻地将未匀浆的组织在过滤器周围移动，以将捕获在组织中的最大量残留液体挤入 50 毫升试管中。现在将细胞过滤器倒置在原始 C 管的顶部，再用 3 毫升培养基冲洗过滤器，使未均质的组织落回 C 管中。

如前所述，将组织再匀浆两个循环，然后再次将第二种匀浆倒入细胞过滤器中。用另外 3 毫升培养基冲洗 C 管。然后通过过滤器过滤上清液，并将残留液体从组织中挤出，如刚才所示。此时，15 毫升试管中应存在约 2.5 mL 的单细胞悬液体积，在 50 mL试管中应观察到约 9 mL

为了将组织上清液与细胞分离，首先在室温下以 600 Gs 离心两管匀浆 15 分钟。将 15 毫升试管中的上清液倒入 1.5 毫升试管中，置于 4 摄氏度，然后丢弃 50 毫升试管中的上清液。然后在坚硬的表面上轻轻敲击每根试管，以打碎每个细胞沉淀。

用 500 微升培养基将松散的细胞沉淀重悬于 50 毫升试管中，并将细胞转移到 15 毫升试管中以重悬第二个沉淀。然后用另外 500 μL 培养基冲洗 50 mL 试管，并将洗液转移到 15 mL 试管中，以实现最大的细胞回收率。通过台盼蓝排除法计数活细胞的数量后，沉淀细胞悬液。

最后，旋转保留的组织上清液。然后小心地将上清液转移到至少一个干净的试管中，不要接触或干扰沉淀，并将其储存在零下 80 摄氏度以备将来的下游分析。