机械解离：一种从组织中获取活细胞的方法

首先，称取一块组织碎片的重量，并测量其长度、宽度和高度。将组织置于含有培养基的培养皿中，使用解剖刀将其切成小块。然后用巴斯德吸管将所有组织转移至C管中，进行匀浆处理。

将试管放入机械解离仪中，根据需要运行解离循环。该仪器利用机械力从组织样本中分离出具有活性的单细胞，同时保持细胞完整性，包括表面蛋白。通过固定在离心管上的细胞滤筛倾倒匀浆液。

将剩余组织重新匀浆，并通过细胞滤筛将匀浆液过滤至离心管中。离心匀浆液并弃去上清液。随后，用培养基重悬细胞沉淀，并将少量细胞悬液转移至含有台盼蓝染料的离心管中。

染色后，将细胞转移至血细胞计数板。计数透明的活细胞。死细胞会吸收染料，因其细胞膜不完整。在以下方案中，我们将对新鲜的人体组织进行非酶解离，以定量和定性分析CD45+细胞。

— 首先称量组织样本，然后测量组织的长度、宽度和高度。接着将组织碎片转移至含有1毫升适当化学成分明确、无血清造血细胞培养基的小培养皿中，使用无菌手术刀将样本切成1至2平方毫米的小块。随后，将培养皿中的内容物转移至机械解离仪C管中，并用2毫升培养基冲洗培养皿和手术刀。

将洗涤液加入C管中，然后连续运行8.01机械解离程序两次，以轻柔地将组织碎片均质化为单细胞悬液。第二次循环结束后，将匀浆液通过40微米细胞滤筛倒入50毫升锥形管中。接着，使用之前洗涤培养皿所用的同一支巴斯德吸管，将C管中残留的液体转移至细胞滤筛中。

接下来，使用1毫升移液器将滤过的液体转移至15毫升锥形管中，并用额外3毫升培养基冲洗C管。将此洗涤液通过细胞筛网转移至50毫升管中。然后用干净的1毫升枪头轻轻搅动筛网上的未均质组织，以尽可能挤出残留在组织中的液体，使其全部进入50毫升管中。现在将细胞筛网倒置在原来的C管上方，再用3毫升培养基冲洗筛网，使未均质的组织重新落回C管中。

按照上述方法，将组织再次重悬并匀浆两个循环，然后将第二次的匀浆液再次通过细胞筛过滤。用另外3 mL培养基冲洗C管。接着将上清液通过细胞筛过滤，并按上述方法挤出组织中残留的液体。此时，15 mL离心管中应含有约2.5 mL的单细胞悬液，50 mL离心管中应观察到约9 mL液体。

为将组织上清液与细胞分离，首先将两管匀浆液在室温下以600 ×g离心15分钟。将15毫升试管中的上清液倾入1.5毫升试管中，并置于4摄氏度环境中，弃去50毫升试管中的上清液。然后轻轻将每支试管在硬质表面上敲击，以充分分散细胞沉淀。

用500微升培养基重悬50毫升离心管中的松散细胞沉淀，并将细胞转移至15毫升离心管中以重悬第二个沉淀。然后用另外500微升培养基冲洗50毫升离心管，并将洗涤液转移至15毫升离心管中，以最大限度回收细胞。通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量后，离心收集细胞悬液中的细胞沉淀。

最后，将保留的组织上清液离心沉淀。然后小心地将上清液转移至至少一个干净的离心管中，注意不要接触或扰动沉淀物，并将其在-80°C下保存，用于后续分析。