软琼脂集落形成实验：一种检测新型化合物对癌细胞增殖影响的方法

首先，取适量浓度的熔融琼脂糖置于锥形管中，加入一定量的温热培养基，轻轻颠倒混匀。将此混合液加入六孔板的每个孔中，使其凝固，即形成底层。接着，用目标化合物处理癌细胞，并加入所需浓度的琼脂糖。

现在，将含有每毫升所需细胞数量的混合液加入每个孔中。此为含细胞层。待培养基凝固后，将培养板在37摄氏度下孵育一周。通过将琼脂糖加入培养基中制备饲养层，并向该混合物中添加目标化合物。轻轻将此饲养层加入每个孔中，待其凝固后，将培养板在37摄氏度下孵育。

每周重复此喂养步骤，以新鲜培养基补充细胞，直至形成克隆。若待测化合物具有抑制致瘤性的功能，则会抑制细胞生长，导致孔中形成的克隆数量较少。在以下实验方案中，我们将进行软琼脂 琼脂 通过菌落形成实验研究PADI抑制剂对乳腺癌细胞致瘤性的影响。

开始此操作前，先配制3%的2-羟乙基琼脂糖。取一个洁净干燥的100毫升玻璃瓶，加入0.9克2-羟乙基琼脂糖，随后加入30毫升蒸馏水。将混合物放入微波炉加热15秒，并轻轻摇晃。重复此步骤，直至琼脂糖粉末完全溶解。接着，将含有溶液的瓶子进行高压灭菌15分钟。

将琼脂糖溶液冷却至室温后再进行后续操作。将数个5毫升和10毫升移液器置于37摄氏度培养箱中预热，以防止操作过程中琼脂糖在移液器内凝固。将预先配制的3% 2-羟乙基琼脂糖溶液瓶盖稍松开，先在微波炉中加热15秒，然后轻轻旋转混匀，再加热15秒。

摇动琼脂糖溶液时需小心，因为溶液暴露在空气中会上升并可能溢出。如果瓶中仍有未溶解的凝胶残留物，可再用微波炉加热数秒。在后续步骤中，将装有琼脂糖溶液的瓶子置于45摄氏度水浴中，以防止琼脂糖溶液过早凝固。

接着，使用预热的移液管将12毫升温热的培养基转移至一个无菌的50毫升锥形管中。立即加入3毫升3%琼脂糖溶液，并轻轻颠倒锥形管，使琼脂糖与培养基充分混匀。然后，将2毫升该混合液轻柔地加入六孔细胞培养板的每孔中，避免产生任何气泡。将六孔细胞培养板水平放置于4°C条件下孵育1小时，使混合液充分凝固。

待混合物凝固后，将培养皿放入37摄氏度的培养箱中孵育30分钟。底层现已准备就绪，可供使用。

该实验步骤的一个难点在于，确保所有细胞均匀分布，并且在将融化的琼脂糖凝胶加入各孔之前不会过早凝固，以保证在加入液体琼脂糖凝胶前细胞已充分混匀于培养基中。此外，移液器需提前预热，以避免操作过程中溶液因温度下降而凝固。

为制备含细胞的层，首先用胰蛋白酶消化MCF10DCIS细胞，并将其稀释至细胞浓度为每毫升40,000个细胞。然后使用预热的移液器吸取8毫升培养基，转移至无菌的50毫升锥形管中。立即向锥形管中加入2毫升3%琼脂糖溶液，并轻轻颠倒混匀，使琼脂糖与培养基充分混合。注意避免产生气泡。

接下来，取两毫升细胞，加入二甲基亚砜（DMSO）中浓度为2微摩尔的BB-chlor-amidine进行处理，或仅加入DMSO作为对照。处理后，将细胞与0.6%琼脂糖按1:1比例混合，使BB-chlor-amidine的终浓度为1微摩尔。然后取一毫升细胞-琼脂糖混合液，轻轻加入六孔培养板的底层中。

将六孔培养板水平放置在4°C的平坦表面上，至少静置15分钟，使顶层凝固。混合物凝固后，将培养板放入37°C培养箱中培养一周，然后添加饲养层。开始制备饲养层时，先将预先配制的3% 2-羟乙基琼脂糖溶液如前所述进行微波加热，并将琼脂糖溶液瓶置于45°C水浴中平衡。

将1毫升3%的琼脂糖溶液与9毫升温热培养基加入50毫升锥形管中，轻轻颠倒混匀，使琼脂糖与培养基充分混合。避免产生气泡。用BB-氯-脒处理混合物后，轻轻将1毫升混合物加入六孔培养板的每个孔中，每个孔均含有底层和软层。然后将六孔培养板水平放置于4°C的平面上至少15分钟，使混合物凝固。

待饲养层凝固后，将培养板放入37摄氏度的培养箱中。每周重复一次该饲养操作，通过在现有饲养层上覆盖1毫升0.3%琼脂糖培养基处理溶液，为细胞补充新鲜培养基，直至观察到克隆形成。