0 次观看 • 5:55 分钟 • April 30th, 2023
— 首先，将一只已处死的小鼠置于解剖板上。在腹部上方沿中线切开皮肤和腹膜。刺破膈肌，沿肋骨和肋笼剪开至气管。在气管上做一个小切口。轻轻将一根针插入气管内，注意不要损伤隆嵴，并用镊子固定。将处于正常体温下的低熔点琼脂糖注入肺部。缓慢撤出注射器，但保留针头在原位，以防止琼脂糖回流。
将冷的 PBS 倒在肺组织上以促进琼脂糖凝固。拔出针头，并用镊子夹紧气管以防止未凝固的琼脂糖回流。剪开胸骨，用镊子夹住气管，用剪刀将其剪断。将肺组织从胸腔中取出。在培养基中分离肺叶。置于生理条件下用于显微成像的成像孔板中。琼脂糖可在生理温度下维持肺组织的形态结构，有助于观察活细胞间的相互作用。在接下来的实验方案中，我们将演示肺组织的离体活体成像，以研究癌细胞与基质细胞之间的相互作用。
— 为进行离体活体成像，首先将小鼠固定在覆盖有吸水垫的聚苯乙烯泡沫板上，并用70%乙醇对动物进行消毒。接着，使用手术剪通过皮肤进行横向剑突下切口，随后对腹膜进行类似的切口。然后，将解剖板转为垂直位置，剪断降主动脉，使血液流入腹腔而非胸腔。
在膈肌上剪开一个小口以释放负压，然后沿肋骨剪开，切除膈肌以暴露肺部。使用手术剪沿肋骨上方的皮肤剪至气管，保留肋骨完整。随后将皮肤与肋骨分离，并清除周围结缔组织以暴露气管，注意避免损伤气管本身。在暴露的气管上，靠近喉部尽可能近的位置，沿软骨环平行方向剪开一个直径约1毫米的小口，注意不要完全剪断气管。
然后将20号针头轻柔地插入气管4至5毫米，过程中不应有阻力。针头末端应透过气管可见。用400微升37摄氏度的2%低熔点琼脂糖充满注射器，随后用镊子固定针头。保持解剖板垂直，通过针头将全部温热的琼脂糖缓慢注入肺部。肺部充盈后，在保持针头留在气管内的同时取下注射器，并向肺部倾倒约50毫升20摄氏度的磷酸盐缓冲液（PBS），以促进琼脂糖凝固。
当琼脂糖凝固后，移去针头，并用镊子夹闭气管，以防止未凝固的琼脂糖泄漏。接着，通过胸骨切开术进一步打开胸腔，用镊子夹住气管。然后使用手术剪完全剪断气管。为取出肺组织，轻轻向上牵拉气管，剪除结缔组织和食管，将肺完全从胸腔中取出。
将组织浸入37摄氏度的RPMI 1640培养基中，以洗去多余的血液。使用剪刀和镊子在肺门处剪断肺叶的主支气管，并轻轻分离肺叶。将肺叶转移至24孔成像板的一个孔中，使组织平整面朝下，并加入100微升37摄氏度的RPMI 1640培养基覆盖组织。在肺叶上方放置数个15毫米圆形显微镜盖玻片，防止组织漂浮，并向周围孔中加入温热的PBS，以防止培养基蒸发。随后将24孔板放入气候舱中，并将气候舱转移至共聚焦显微镜载物台上。