0 次观看 • 4:45 分钟 • April 30th, 2023
— 首先，在4°C条件下过夜解冻基底膜基质小瓶。基底膜基质含有存在于肿瘤微环境中的蛋白质，有助于在体外维持癌细胞的特性。次日，将基底膜基质小瓶置于冰上，以保持其液态。将肺癌细胞转移至预冷的离心管中，并在4°C下离心。吸除上清液，轻轻敲击管壁以松动沉淀物，并将沉淀物置于冰上。接着，向该管中加入适量的基底膜混合液，混匀以形成均匀的细胞悬液。所有操作步骤均需在低温下进行，以防止基底膜发生凝胶化。
将适量的细胞基质悬液转移至预冷的孔板中每个孔的中央，覆盖整个孔底。孵育孔板，使基质凝固。在显微镜下观察，确保细胞在基质中分布均匀。向每个孔中加入3D完全培养基，并在37摄氏度下孵育。该培养基可促进细胞与基质的相互作用，从而使细胞形成具有腺泡样结构的类器官。在以下实验方案中，我们将进行TUM622肺癌细胞的3D培养。
首先，在4摄氏度冰箱中过夜解冻基底膜基质冻存管。将2毫升塑料移液管和枪头于负20摄氏度预冷过夜。次日，将用于解离TUM622细胞的试剂——HEPES缓冲液、胰蛋白酶-EDTA和胰蛋白酶中和缓冲液——置于37摄氏度水浴中预热。从冰箱中取出已解冻的基底膜基质，将冻存管置于冰上。将组织培养板放置于置于冰上的金属平台冷却器上进行冷却。将离心管置于冰上的金属冷却架上预冷。根据待准备的孔数及每孔中的细胞浓度，计算所需细胞数量。将TUM622细胞悬液转移至预冷的离心管中，在4摄氏度下，以300 × g于水平转子离心机中离心5分钟。
使用连接无滤芯吸头的移液器，小心吸取上清液，保留约 100 微升培养基在离心管中。轻轻敲击离心管侧壁，使沉淀松动并重新悬浮，然后将其放回冷却架上。使用预冷的 2 毫升移液器，在冰上通过上下吹打数次，轻柔混匀基质。吹打时应保持均匀且适中的速度，避免在此过程中向基质中引入气泡。
将1.1毫升基质转移至每个离心管中。使用预冷的枪头，将每管中的基质上下吹打约10次，以制成均匀的细胞悬液。将310微升细胞-基质悬液转移至预冷的24孔板的每个孔中。将移液器垂直于板面（90度角），将悬液加入孔的中央。悬液会自然扩散并覆盖整个孔。为了便于后续免疫荧光分析，将60微升细胞-基质悬液加入2孔板的孔中心。这样可在体积更小的情况下使基质形成类似圆顶的结构。
将培养板和腔室载玻片放回组织培养孵育箱中，孵育30分钟，使基质凝固。随后，在光学显微镜下检查培养板和载玻片，确保单细胞在基质中均匀分布。向培养板的每孔中加入1毫升预热的3D培养完全培养基，向腔室载玻片的每孔中加入1.5毫升3D培养基。然后将其放回孵育箱中。