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- 在 3D 共培养中，多种细胞类型在基质中一起生长，如基底膜基质，模拟天然细胞外基质微环境，促进细胞间和细胞间基质相互作用。为了建立嵌入式 3D 共培养物，在基底膜基质中制备癌症相关成纤维细胞或 CAF 和肺癌细胞的均匀悬浮液，以 2 比 1 的比例采集。将悬浮液保持在冰上，以防止基质在环境温度下凝固。
将适当体积的悬浮液转移到细胞培养板中。在 37 摄氏度下孵育所需的持续时间，以将细胞共嵌入基质中。为了建立重叠的 3D 共培养物，在基底膜基质中以所需的细胞密度制备肺癌细胞的悬浮液。将悬浮液保持在冰上。将适当体积的这种细胞基质悬浮液移液到细胞培养板中。在 37 摄氏度下孵育以建立包埋的癌细胞单一培养物。
随后将悬浮在首选培养基中的所需体积的 CAF 转移到包埋的癌细胞上。在 3D 共培养中，CAF 增强癌细胞球状体的形成并吸引癌细胞，从而产生泪滴状结构。在该方案中，我们将共培养 TUM622 肺癌细胞和 CAF 以研究它们的相互作用。
- 如前所述，在制备 TUM622 和 CAF 的细胞悬液后，通过将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝混合来计数 CAF 细胞密度。在血细胞计数器的两个腔室中分别加入 10 μL 混合物，以计数和计算细胞密度。要将 TUM622 细胞和 CAF 共嵌入基底膜基质中，首先根据细胞密度信息计算用于铺板的所需细胞数。CAF 以 2 比 1 的 TUM622 细胞比例接种。将计算体积的 TUM622 以及 CAF 细胞悬液转移到同一离心管中。离心并吸出所有培养基。重悬于基底膜基质中，并将 310 μL 混合物接种到 24 孔板的每个孔中。对于免疫荧光，如前所述，将 60 微升 TUM622 和 CAF 混合物转移到腔室载玻片中。
为了在基底膜基质中将 TUM622 与重叠的 CAF 共培养，首先如前所述设置 TUM622 单一培养。将两倍数量的 CAF 悬浮液转移到离心管中，并在室温下以 300 倍"g"离心 5 分钟。吸出上清液并将 CAF 重悬于一毫升 3D 培养基中。将 1 mL CAF 悬液转移到含有包埋的 TUM622 细胞的孔中。
