在剂量递增前确定IC50为何至关重要？

通过MTT实验确定基础IC50值，可为以1/10 IC50浓度启动剂量递增提供参考浓度，从而在不引起急性细胞毒性的情况下施加选择性压力。这能够促使细胞耐药性逐步发展，而非导致急性细胞死亡。

MTT 实验结果如何提示耐药性的产生？

MTT检测通过测定活细胞中线粒体还原酶活性产生的甲臜量来评估细胞活力，其在570 nm处的光密度值与细胞数量呈正相关；当细胞在初始抑制生长的逐步增加的阿法替尼浓度下仍能维持活力时，即可确认其具有耐药性。

是什么使得耐药细胞系的可靠复制成为可能？

在亚融合状态下逐步进行剂量递增，每次传代时浓度增加10-20%，可提供一种标准化的选择压力方案，该方案可在不同实验室间重复，以生成同基因型的耐药模型。

为什么复制要求对于跨职能协作至关重要？

在重复实验中一致的耐药性发展可确保观察到的表型是由遗传因素驱动，而非随机事件所致，从而在靶点验证研究中实现从发现、检测方法开发到临床前团队之间的可靠交接。

确认耐药性发展需要进行哪些统计分析？

通过比较亲本细胞和剂量递增细胞的MTT实验所得存活率曲线来确认耐药性，需进行统计学显著性检验（例如IC50偏移分析），以证明随时间推移药物敏感性降低。

剂量递增：一种在癌细胞中诱导药物耐药性的方法

JoVE Encyclopedia of Experiments

癌症研究

0 次观看 • 4:17 分钟 • April 30th, 2023

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— 酪氨酸激酶抑制剂（TKI）可阻断激酶受体与ATP结合，从而抑制磷酸化反应。首先将癌细胞接种于含生长培养基的培养板中，待其达到适宜密度后，将细胞转移至多个孔中。经过过夜培养后，在多个孔中加入不同浓度的药物，并继续培养指定时间。随后加入MTT（一种水溶性染料）以检测细胞活力。活细胞内的线粒体酶可将MTT转化为不溶性的紫色甲臜沉淀。

通过加入合适的溶解剂终止反应，并用分光光度法测定甲臜。该方法称为MTT法。以甲臜表示的活细胞数对药物浓度作图。使用软件计算杀灭50%细胞的药物浓度，即抑制浓度IC₅₀。

接下来，在生长培养基中培养癌细胞，并将其接种到三个不同的培养皿中。当细胞达到亚汇合状态后，加入1/10稀释的IC₅₀浓度药物。继续培养细胞并进行MTT实验。重复此过程，逐步增加药物剂量。由于蛋白质序列发生突变，癌细胞会逐渐对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）产生耐药性。

以下方案展示了通过剂量递增法诱导PC9细胞对阿法替尼产生耐药性的过程。

— 为确定合适的阿法替尼耐药浓度，将PC9细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，于10厘米细胞培养皿中用生长培养基进行培养。将PC9细胞重悬于生长培养基中，浓度为每毫升4×10⁴个细胞，并以每孔50微升细胞悬液接种至96孔微孔板中。在细胞培养箱中过夜培养后，向每孔加入50微升阿法替尼溶液，按所示浓度设置六个复孔。在细胞培养箱中继续培养96小时后，向每孔加入15微升MTT染料。

在细胞培养孵育箱中孵育 4 小时后，向每孔加入 100 微升溶解终止液，并将培养板放回孵育箱中过夜。次日早晨，使用酶标仪在 570 纳米处测量光密度。对于持续阿法替尼暴露，将 PC9 细胞在含有 10 毫升生长培养基的 P100 培养皿中培养，直至细胞达到亚汇合状态。

将亚融合状态的细胞培养物分别转移至三个新的P100培养皿中，每个初始培养皿加入9毫升生长培养基，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养。次日早晨，向每组三个培养皿中加入0.1纳摩尔或半数最大抑制浓度的1/10量的阿法替尼。当阿法替尼处理的细胞再次达到亚融合状态时，使用1毫升移液器充分混匀各培养物，然后从每个培养皿中取1毫升细胞悬液转移至含有9毫升新鲜生长培养基的新P100培养皿中。

在新培养物中加入比原浓度高10%至20%的阿法替尼，并在培养物每达到亚融合状态时逐步增加阿法替尼浓度，进行梯度剂量递增，持续10至12个月。当阿法替尼浓度达到1微摩尔时，按照所示方法进行MTT实验，以确认细胞已产生阿法替尼耐药性。