0 次观看 • 5:38 分钟 • April 30th, 2023
首先，在含有组织培养基的T形瓶中接种肺癌细胞，并过夜培养。接着，将miRNA与转染试剂悬浮于转染培养基中。吸除原有培养基，加入含有miRNA的转染培养基，以将miRNA导入癌细胞。miRNA是一种非编码RNA分子，可与互补的mRNA序列结合，从而阻断基因表达。将T形瓶置于培养箱中孵育所需的时间。
接着，更换为组织培养基并过夜培养。加入胰蛋白酶以进行细胞解离。将混合物转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的离心管中，并进行离心。弃去上清液，加入裂解缓冲液以裂解细胞，并加入超纯乙醇以沉淀核酸。将混合物置于分离柱中以纯化核酸，随后离心。
弃去流穿液，加入洗涤缓冲液以去除裂解的细胞膜，离心。弃去洗涤缓冲液，加入DNase及DNase消化缓冲液以去除样品中的DNA，离心。加入RNA提取缓冲液以分离RNA，离心。收集上清液中存在的RNA。在以下实验方案中，我们将从经miRNA处理的肺癌细胞中进行RNA提取。
— 首先，将癌细胞接种于适当的培养瓶中，接种量需足以进行RNA和蛋白质提取，以用于qPCR或微阵列分析检测基因表达。随后，在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的培养基中培养过夜。
第二天，将 microRNA 143 和 microRNA 506 分别用培养基稀释至终浓度各为 100 纳摩尔，制备用于转染的 microRNA 样品。从培养箱中取出培养瓶，弃去培养基，用 1 × PBS 洗涤。
所有未处理的对照组仅包含含有细胞的不完全培养基。将细胞置于转染培养基中，在培养箱中孵育6小时。6小时后，移除培养基，并更换为4毫升新鲜的完全培养基。分别在24小时和48小时后通过胰蛋白酶消化法收集细胞。
随后，每管用 1× PBS 洗涤两次，并弃去上清液。如需在后续时间进行 RNA 提取，可将细胞于 -80 摄氏度冷冻保存。
－ 使用RNA试剂盒进行RNA提取，具体操作按照制造商说明书进行。首先将试管从负80摄氏度取出，使其解冻。
— 加入 300 微升裂解缓冲液，上下吹打以破坏细胞膜。加入等体积的 100% 超纯乙醇。充分混匀后转移至分离柱中。离心并弃去穿流液。
加入400 µL洗涤缓冲液，离心以去除缓冲液。每个样品中加入5 µL DNA酶I和75 µL DNA消化缓冲液，孵育15分钟。然后用400 µL RNA提取缓冲液洗涤样品。
接下来用RNA洗涤缓冲液洗涤两次。向吸附柱中加入无核酸酶的水，离心后收集RNA。测定RNA浓度，此阶段可将2微克RNA样品用于RNA测序。