细胞周期分析:研究miRNA转染肺癌细胞中细胞周期调控的方法

0 次观看3:34 分钟 • April 30th, 2023

- microRNA(miRNA)是一种小型非编码RNA。在miRNA转染或导入细胞后,会形成miRNA蛋白复合物。该复合物可靶向并结合特定的mRNA,负向调控其表达,从而阻滞细胞周期进程。

开始分析时,向收获的转染了miRNA的肺癌细胞培养物中加入适当的脱水固定剂。该固定剂可固定细胞并通透细胞膜。将细胞与碘化丙啶(一种荧光核酸染料)和核糖核酸酶的混合物共同孵育。

染料进入细胞,对DNA和RNA均进行染色。酶可特异性降解RNA,从而实现DNA的准确定量。使用流式细胞仪,根据单个细胞的荧光强度,确定停滞在不同细胞周期时相的细胞比例。

处于静止期和生长期的细胞DNA含量较低,因此荧光强度也较低。处于G2期、DNA含量加倍的细胞产生的荧光强度是前者的两倍。处于DNA合成期的细胞诱导出介于另外两个细胞群之间的荧光值。以下实验方案将通过PI染色和流式细胞术检测miRNA处理的肺癌细胞的DNA含量,分析其细胞周期调控情况。

— 按照本视频前面部分所述方法转染细胞。通过胰酶消化法将每份样品的细胞分别收集至15毫升无菌离心管中。随后,用1× PBS洗涤细胞两次,每次在751 ×g离心5分钟,然后弃去上清液。通过移液加入200微升预冷的1× PBS重悬细胞并吹打破碎细胞沉淀。

在轻轻涡旋振荡的同时,将 2 毫升 70% 的预冷乙醇逐滴加入管中,以固定细胞。在室温下孵育 30 分钟,然后置于 4 摄氏度环境中 1 小时。从 4 摄氏度取出离心管并进行离心。

加入 2 mL 冰冷的 PBS,涡旋混匀,然后通过离心去除上清液。在每个样品中加入 500 微升含有碘化丙啶和核糖核酸酶 A 的 1× PBS,其浓度分别为 50 和 200 微克/毫升,于室温孵育 30 分钟。将样品转移至适当的管中,避光保存,并上流式细胞仪检测。

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最后更新:29 八月 2026