0 次观看 • 3:34 分钟 • April 30th, 2023
- microRNA(miRNA)是一种小型非编码RNA。在miRNA转染或导入细胞后,会形成miRNA蛋白复合物。该复合物可靶向并结合特定的mRNA,负向调控其表达,从而阻滞细胞周期进程。
开始分析时,向收获的转染了miRNA的肺癌细胞培养物中加入适当的脱水固定剂。该固定剂可固定细胞并通透细胞膜。将细胞与碘化丙啶(一种荧光核酸染料)和核糖核酸酶的混合物共同孵育。
染料进入细胞,对DNA和RNA均进行染色。酶可特异性降解RNA,从而实现DNA的准确定量。使用流式细胞仪,根据单个细胞的荧光强度,确定停滞在不同细胞周期时相的细胞比例。
处于静止期和生长期的细胞DNA含量较低,因此荧光强度也较低。处于G2期、DNA含量加倍的细胞产生的荧光强度是前者的两倍。处于DNA合成期的细胞诱导出介于另外两个细胞群之间的荧光值。以下实验方案将通过PI染色和流式细胞术检测miRNA处理的肺癌细胞的DNA含量,分析其细胞周期调控情况。
— 按照本视频前面部分所述方法转染细胞。通过胰酶消化法将每份样品的细胞分别收集至15毫升无菌离心管中。随后,用1× PBS洗涤细胞两次,每次在751 ×g离心5分钟,然后弃去上清液。通过移液加入200微升预冷的1× PBS重悬细胞并吹打破碎细胞沉淀。
在轻轻涡旋振荡的同时,将 2 毫升 70% 的预冷乙醇逐滴加入管中,以固定细胞。在室温下孵育 30 分钟,然后置于 4 摄氏度环境中 1 小时。从 4 摄氏度取出离心管并进行离心。
加入 2 mL 冰冷的 PBS,涡旋混匀,然后通过离心去除上清液。在每个样品中加入 500 微升含有碘化丙啶和核糖核酸酶 A 的 1× PBS,其浓度分别为 50 和 200 微克/毫升,于室温孵育 30 分钟。将样品转移至适当的管中,避光保存,并上流式细胞仪检测。
本研究探讨微小RNA(miRNA)在调控肺癌细胞周期中的作用。通过使用流式细胞术和碘化丙啶染色,旨在定量分析DNA含量,并评估经miRNA处理的细胞的细胞周期时相。
对转染miRNA的肺癌细胞进行定量细胞周期分析,能够精确探究与肿瘤药物发现相关的细胞周期调控机制。基于流式细胞术的DNA含量检测可为早期治疗项目的靶点验证和机制去风险化提供可操作的数据支持。该方法有助于在肿瘤研发管线的关键转折点上建立可预测的信心。
这种基于流式细胞术的细胞周期分析可融入从发现到临床前的研究连续过程,支持肿瘤学研究中的靶点验证和先导化合物的鉴定。
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最后更新:29 八月 2026