为什么零假设检验对PD-L1流式细胞术很重要？

在PD-L1流式细胞术中进行零假设检验，能够客观评估实验组之间观察到的标志物表达是否存在显著差异，从而支持严格的目标验证，并减少早期发现中的假阳性结果。

自变量隔离如何融入肺细胞悬浮工作流程？

分离酶浓度和孵育时间等变量可确保细胞得率或标志物表达的变化归因于实验条件，从而提高发现流程中的可重复性和可解释性。

定量流式细胞术测量在肺部模型中能够实现什么？

定量流式细胞术可提供关于细胞群体和标志物表达的精确数据，从而实现不同条件下的比较分析，并支持肿瘤免疫学研究中的数据驱动决策。

为什么重复性要求对于肺细胞制备方案至关重要？

重复实验可确保不同实验和团队之间的细胞分离及流式细胞术结果具有一致性，从而促进跨学科协作以及临床前项目的可靠推进。

在开展流式细胞术PD-L1研究之前，需要具备哪些统计学分析能力？

需要进行稳健的统计分析，以解读流式细胞术数据、评估标志物表达差异的显著性，并指导靶点验证工作流程中的决策。

小鼠肺组织流式细胞术样品制备：从肺组织制备单细胞悬液用于流式细胞分析

JoVE Encyclopedia of Experiments

癌症研究

0 次观看 • 3:48 分钟 • April 30th, 2023

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- 首先取一只已处死的小鼠，用胶带将其固定在解剖板上。用剪刀剪开皮肤，沿膈肌做纵向切口并剪开肋骨，暴露胸腔以显露心脏和肺。接着，在左心室做一小切口。随后找到右心室，将装有磷酸盐缓冲液（PBS）的注射器插入右心室腔内。通过右心室灌注 PBS，使血液从左心室预先制作的切口流出，直至肺组织变为白色。取出含有肿瘤结节的肺组织，将其剪切成小块。

将组织块置于肺组织消化缓冲液中孵育。肺组织消化缓冲液中的胶原酶有助于分离细胞，DNA酶有助于清除死细胞释放的DNA。将所得悬液通过细胞筛滤过，以去除细胞团块，使细胞悬液均匀。离心后，将沉淀重悬于氯化铵钾缓冲液中，以裂解残留的红细胞。再次离心以收集沉淀中的白细胞和肿瘤细胞。将沉淀重悬于添加胎牛血清（FCS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，以维持细胞稳定性。在后续实验方案中，我们将演示为流式细胞术分析制备肺组织细胞悬液的方法。

在达到适当的实验终点后，将尸体浸入70%乙醇中，并将动物固定在解剖板上。沿腹侧正中线做一切口，轻轻翻转皮肤以暴露胸壁肌肉和腹腔器官。用剪刀刺破膈肌，并剪开肋骨以暴露胸腔。在左心室切开一个小口，使用27号针头经右心室灌注肺组织，每次灌注使用6至8毫升冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），共灌注三次。最后一次灌注后，肺组织应完全无血，呈现白色。收获肺组织后，用剪刀将肺组织剪成小块。

将肺组织碎片转移至含有1.5毫升肺组织消化缓冲液的2毫升微量离心管中，在37摄氏度下振荡孵育30至60分钟。消化结束后，将细胞悬液通过70微米细胞筛网转移至50毫升离心管中，并使用无菌10毫升注射器活塞末端将残留的组织碎片压过滤网。用15毫升添加了2% FCS的PBS冲洗筛网，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于1毫升氯化铵-钾裂解缓冲液中，在室温下孵育5分钟，再次离心细胞。随后将白细胞沉淀重悬于1毫升添加了2% FCS的PBS中，根据实验方案对细胞进行染色，用于流式细胞术分析。