体外光毒性检测：一种基于光动力疗法评估光敏剂在肺癌细胞中光毒性潜力的方法

－ 光动力疗法（PDT）是一种利用光敏剂的光疗方法，光敏剂是在特定波长光照下被激活的分子。处于激发态的光敏剂可将细胞内的分子氧转化为活性氧物种，从而导致细胞死亡。开始实验前，需制备含有适当浓度光敏剂的纳米颗粒药物递送系统，可单独使用光敏剂，也可与待测药物联合使用。

将该纳米颗粒悬液以所需浓度加入肺癌细胞培养物中。在避光条件下孵育适当时间，以促进细胞对纳米颗粒的摄取。随后更换为所需的培养基。接着，将光动力治疗光纤激光器置于培养物上方适当距离处，以确保光照均匀。以合适的波长照射细胞预定时间，然后过夜孵育。

更换为合适的细胞毒性检测溶液。使用微孔板读数仪检测细胞活力，以定量分析实验处理的细胞毒性效应。含有光敏剂的辐照细胞表现出活力下降。在以下实验方案中，我们将对包载于透明质酸-神经酰胺纳米颗粒中的光敏剂假密环菌素B和抗癌药物紫杉醇，在A549肺癌细胞中进行体外光毒性分析。

首先，按照随附的文字实验方案合成透明质酸-神经酰胺。使用3.5千道尔顿的透析膜纯化产物，并进行冻干。

接下来，分别制备单独的透明质酸-神经酰胺纳米颗粒、含有光敏剂的透明质酸-神经酰胺纳米颗粒，以及同时含有抗癌剂和光敏剂的透明质酸-神经酰胺纳米颗粒。

将肺癌细胞系 A549 以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度接种至 24 孔细胞培养板的各孔中，于 37°C 培养 24 小时。次日，吸去培养基，并用 1 毫升 PBS 洗涤细胞。

然后通过涡旋振荡将制备的纳米颗粒溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，使光敏剂 hypocrellin B 的终浓度为每毫升2微摩尔。

分别向四个孔中各加入 1 毫升 PBS、1 毫升空载透明质酸-神经酰胺纳米颗粒、1 毫升含有光敏剂的纳米颗粒，以及 1 毫升同时含有光敏剂和抗癌药物的纳米颗粒。

实验结束后，盖上培养板，在避光条件下于37摄氏度孵育4小时，以使细胞摄取纳米颗粒。随后吸除所有溶液，并加入1毫升冷的PBS洗涤细胞。

再重复洗涤步骤一次，然后加入新鲜培养基。接着，将24孔培养板置于光动力治疗光纤下，并将光纤置于距离第一孔1厘米处。

— 光动力疗法光纤与细胞之间的距离是本研究的关键因素。确定能够用光照覆盖整个细胞的最佳距离至关重要。

— 然后戴上护目镜并关闭灯光。在黑暗中用激光照射细胞5至40秒，以激活含光敏剂的纳米颗粒中的高活性单线态氧及其他自由基。

光照处理后，将细胞在避光条件下孵育24小时。接着，吸除培养基，并用1毫升冷的PBS缓冲液洗涤细胞。重复洗涤步骤一次，然后向每孔中加入100微升培养基和10微升细胞毒性检测试剂。

在避光条件下将细胞于溶液中孵育两小时，然后将所有样品转移至96孔板中。使用酶标仪在450纳米波长处测定吸光度。