三维DNA荧光原位杂交：一种在染色体上定位特定基因的技术

— 取一根表面附着细胞并经免疫荧光染色的功能化导线，用冰冷的盐酸钠柠檬酸盐（SSC）溶液清洗。将导线放入含有荧光标记探针的微量离心管中，并用导线塞封闭。将微量离心管置于杂交炉内的避光湿盒中，在75摄氏度下孵育，以使细胞内的DNA变性。

将反应室转移至37摄氏度的烘箱中，使探针与DNA上的互补序列结合。随后，从烘箱中取出反应室并取出金属丝。将金属丝浸入含有SSC溶液的离心管中，在所需温度下进行处理。使用含Tween的SSC溶液洗涤金属丝，以去除非特异性结合或部分杂交的探针，最后再用蒸馏水洗涤一次。

将导线干燥后，把功能化探针置于DAPI溶液中孵育，以染色细胞核。用PBS冲洗导线并自然晾干。将导线置于荧光显微镜下观察。与目的基因杂交的探针在细胞核内呈现为荧光斑点。在以下实验方案中，我们将进行三维DNA荧光原位杂交（3D DNA FISH），以检测肺癌细胞中ALK基因的易位情况。

- 在进行DNA FISH实验前3小时，将杂交炉预热至75摄氏度，将干热炉设定为37摄氏度。将0.4倍浓度的SSC溶液冷却至4摄氏度。用预冷至冰浴温度的0.4倍SSC溶液清洗金属丝3次。在避光条件下于通风橱内干燥金属丝10分钟。

10分钟后，涡旋并离心探针5秒。取10微升探针液滴入玻璃微量管中，然后用实验室封膜覆盖。将微量管包裹在置于50毫升离心管中的干燥吸水纸上，短暂离心。小心将干燥的金属丝放入微量管中，并插入金属丝塞。然后，用橡胶胶水密封金属丝塞。

将载玻片放入杂交炉中的暗湿盒内，75 摄氏度孵育 8 分钟，以实现完全的 DNA 变性。8 分钟后，将湿盒转移至 37 摄氏度的干式加热炉中过夜。将含有 0.4 倍 SSC 溶液的玻片染色缸放入设定为 72 摄氏度的水浴中。监测 0.4 倍 SSC 溶液的温度，直至达到 72 ± 1 摄氏度。

接下来，准备两个玻璃烧杯——一个装有两倍浓度的 SSC 加 0.05% Tween 溶液，另一个装有蒸馏水。从干热烘箱中取出湿化室。使用镊子小心地从金属丝塞子上移除橡胶胶水，并将金属丝的未涂层端穿过端塞，注意不要损坏功能化尖端。

将金属丝浸入72摄氏度的0.4倍SSC溶液中2分钟。在室温下，用含0.05% Tween的2倍SSC溶液洗涤金属丝30秒。随后，在室温下用蒸馏水洗涤金属丝。在避光条件下，于通风橱中干燥金属丝10分钟。将金属丝的功能化尖端与预先配制的DAPI溶液在2毫升小瓶中孵育。用1倍PBS冲洗金属丝两次，并使其空气干燥。

将导线置于导线固定夹中，并小心地将功能化尖端穿过专用固定夹的入口，直至尖端与耦合点对齐。将专用固定夹放置在显微镜载物台上。使用20倍物镜调节显微镜焦距。首先对专用支架进行粗调聚焦，然后在DAPI通道中呈现亮色的细胞上进行精细调节。