0 次观看 • 3:24 分钟 • April 30th, 2023
- 溴脱氧尿苷（Bromodeoxyuridine，BrdU）是一种合成的胸苷核苷类似物。在细胞周期的合成期，BrdU 可取代胸苷并整合到新合成的 DNA 中。整合的 BrdU 可用于追踪细胞周期的进程。为了检测已整合的 BrdU，首先需固定细胞并对其进行透化处理，以增加其通透性。
接下来，用DNA酶处理细胞，以切断DNA链并暴露掺入的BrdU。随后，加入合适的荧光标记抗BrdU抗体。该抗体进入细胞核，并迅速与DNA中暴露的BrdU结合。
此外，用适当的荧光DNA结合染料处理细胞。该染料与DNA结合，从而可定量总DNA含量。使用流式细胞术检测BrdU标记物和DNA的荧光信号。
通过标记的DNA的荧光强度，可根据总DNA含量的变化来区分处于不同细胞周期阶段的细胞。BrdU的荧光信号可识别已掺入BrdU的细胞当前所处的细胞周期位置。
在此示例中，我们将对 NALM-6 急性淋巴细胞白血病细胞进行 BrdU 免疫荧光染色。
— 在进行抗体染色前，先用DNA酶处理细胞。将细胞重悬于100微升DNA酶溶液中，在37摄氏度下孵育1小时。加入1毫升洗涤缓冲液，离心细胞后弃去上清液。可与BrdU染色同时进行针对其他细胞内标志物的抗体染色。
－ 准备补偿对照非常重要，补偿对照应包括未染色的细胞以及分别用每种单一荧光染料标记的细胞。理想情况下，补偿对照应使用与实验管中相同的抗体。
— 将细胞重悬于50微升洗涤缓冲液中，每10^6个细胞加入1微升BrdU抗体。如果使用针对其他特定细胞内抗原的抗体，也应在此时加入。室温下孵育细胞20分钟。
20分钟后，用一毫升洗涤缓冲液洗涤细胞，操作如前所述。最后，对DNA进行染色以进行细胞周期分析。轻轻敲击离心管使沉淀松散，加入20微升7-AAD溶液。每批细胞必须使用恒定量的7-AAD，这一点至关重要。将细胞重悬于一毫升染色缓冲液中。随后进行流式细胞术分析。