经眶后窦采血法：从小鼠眶后窦分离单个核细胞的方法

— 首先，抓住一只麻醉小鼠的颈部，使眼球突出。将一根细毛细管插入眼的内眦处，通过毛细作用使血液流入收集管中。将血液转移至经EDTA包被的试管中，并置于冰上保存。EDTA可结合钙离子，防止血液凝固；低温可降低细胞的糖酵解活性，并减少微生物污染的风险。

接下来，用含有EDTA的缓冲液稀释血液，并充分混匀。小心地将适量的分离液沿管壁缓慢加入到底部，避免扰动血液层。离心悬浮液。分离液中的聚合物会使红细胞聚集并沉降到管底。单个核细胞和血小板密度低于聚合物，因此沉积在聚合物梯度的上方。

去除含有血浆的上层，收集含有单个核细胞的不透明白色环状层。使用 PBS 稀释细胞，并通过离心去除残留的血浆和血小板。将分离得到的单个核细胞用于后续分析。以下实验方案将演示如何从注射了白血病细胞系 C1498 的同源小鼠中分离单个核细胞。

— 将毛细管插入麻醉后的白血病动物眼睛的内眦。血液将从眶窦流入毛细管，采集量为100至200微升（µL）。取出毛细管后，用无菌纱布轻轻按压眼部以控制出血。随后，将血液转移至EDTA管中，并将管子置于冰上保存，直至进行单个核细胞分离。

为了分离血液单个核细胞，首先加入含1毫摩尔EDTA的磷酸盐缓冲液，使终体积达到500微升。然后将样品转移至微量离心管中。接着，使用配备30号针头的1毫升注射器，小心地将500微升分离液沿管壁缓慢铺加在血液下方，注意避免混匀各层。

通过离心分离细胞，并使用移液器将不透明的白色单核细胞层转移至新的微量离心管中。随后用1毫升PBS洗涤免疫细胞。离心后，将沉淀重悬于600微升FACS缓冲液中，用于流式细胞术染色和分析。