密度梯度离心法：从外周血中分离慢性淋巴细胞白血病细胞的方法

在慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中，B细胞淋巴细胞在骨髓和血液中的数量显著增加。为了从血液样本中分离这些CLL细胞，首先使用人B细胞富集试剂盒处理样本，该试剂盒通过负向选择分离B细胞。试剂盒中的抗体可特异性识别并交联非B细胞和红细胞所表达的抗原，形成致密的复合物。

接下来，将样本叠加在密度梯度介质上，该介质的密度最适合淋巴细胞的分离。经过后续离心，不同血液成分因其密度与梯度介质密度的差异而分离。密度较高的红细胞-非B细胞复合物沉降至介质底部，形成沉淀。密度最低的血浆组分位于最上层。慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞密度较低，在血浆与密度梯度介质的界面处形成一层白色层。

小心地将白色层转移至新的离心管中。再次离心以获得含有纯化慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的沉淀。在以下实验方案中，我们将展示如何从患者血液样本中分离慢性淋巴细胞白血病细胞。

— 从已签署知情同意书的慢性淋巴细胞白血病患者处获取外周血样本，置于含EDTA的采血管中，并附白细胞计数。

— 人类血液样本应被视为具有潜在危险性，因其可能含有经血液传播的病毒。请确保在II级生物安全柜中处理这些样本，并且操作人员始终穿戴实验服和手套。对被血液污染的材料应进行妥善处理，并进行消毒。

- 如果白细胞计数大于或等于每毫升4000万个细胞，则用室温CLL洗涤缓冲液按1:1比例稀释样本。然后 等分试样 将RT密度梯度介质加入适当大小的锥形离心管中。小心地将样品铺加在介质上方，于室温下以400 × g离心30分钟。

使用塑料巴斯德吸管，轻轻收集位于密度梯度介质与CLL洗涤缓冲液界面处的白色单个核细胞层。将分离出的单层细胞转移至一个新的50毫升锥形离心管中。为洗涤细胞，向此单层细胞中加入40毫升CLL洗涤缓冲液，并在室温下以300 × g离心10分钟。

弃去上清液，轻弹管底以重新悬浮沉淀，并重复此洗涤步骤。弃去上清液，再次轻弹管底，然后根据沉淀的大小，用一定体积的CLL洗涤缓冲液重新悬浮细胞沉淀。细胞计数并经流式细胞术检测细胞纯度后，将细胞以所需密度接种至组织培养板中，准备进行刺激或药物处理。