密度梯度离心:一种从外周血中分离 CLL 细胞的方法

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- 在慢性淋巴细胞白血病或 CLL 患者中,骨髓和血液中的 B 细胞淋巴细胞显著增加。为了从血液样品中分离这些 CLL 细胞,首先,用人 B 细胞富集混合物处理样品,该混合物使用阴性选择分离 B 细胞。混合物中的抗体特异性识别并交联非 B 细胞和红细胞表达的抗原,形成致密的复合物。

接下来,将样品分层在具有最适合淋巴细胞分离的密度梯度培养基上。在随后的离心中,不同的血液成分根据其相对于梯度介质的密度变化进行分离。密度较高的 RBC-非 B 细胞复合物通过培养基沉淀,形成沉淀。密度最低的血浆组分形成最顶层。密度较低的 CLL 细胞在血浆密度培养基界面处形成白色层。

小心地将白色层转移到新试管中。再次离心以获得含有纯化 CLL 细胞的沉淀。在以下方案中,我们展示了从患者血液样本中分离慢性淋巴细胞白血病细胞。

- 在 EDTA 采血管中从先前同意的慢性淋巴细胞白血病患者那里获取外周血样本,并附有白细胞计数。

- 人类血液样本应被视为危险品,因为它们可能含有血源性病毒。请确保这些样品在 II 级生物安全柜中处理,并且用户始终穿着实验服和手套。处理受血液污染的材料并对其进行消毒。

- 如果白细胞计数等于或大于 4000 万个细胞/毫升,则用 RT CLL 洗涤缓冲液以 1 比 1 的比例稀释样品。然后将 RT 密度梯度培养基分到适当大小的锥形离心管中,用于样品。小心地将样品铺在培养基上,并在室温下以 400 倍 G 离心 30 分钟。

使用塑料巴斯德移液管,轻轻收集在密度梯度培养基和 CLL 洗涤缓冲液界面处收集的单核细胞白色层。将此分离的单层转移到新鲜的 50 ml 锥形离心管中。要洗涤细胞,向该单层细胞中加入 40 mL CLL 洗涤缓冲液,并在室温下以 300 倍 G 离心 10 分钟。

弃去上清液,轻弹试管底部以重新悬浮沉淀,然后重复此洗涤。弃去上清液,再次轻弹试管底部,然后根据沉淀的大小,将细胞沉淀重悬于定体积的 CLL 洗涤缓冲液中。对细胞进行计数并进行流式细胞术检查细胞纯度后,将细胞按所需细胞密度放入组织培养板中,准备进行刺激或药物治疗。

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Last updated: 25 July 2026