0 次观看 • 4:25 分钟 • April 30th, 2023
在白血病细胞中，某些大分子（如部分肿瘤抑制蛋白）在细胞核与细胞质之间的转运受到异常调控。这些蛋白的错误定位使其失去活性，导致白血病细胞不受控制地增殖。我们可通过制备白血病细胞的细胞质和细胞核组分，来确定这些蛋白的异常定位情况。
首先取所需体积的白血病细胞于微量离心管中，离心以形成细胞沉淀。将沉淀重悬于低渗裂解缓冲液中，然后加入所需浓度的去污剂。低渗裂解缓冲液可使细胞吸水膨胀并破坏细胞质膜，而核膜保持完整，从而分离出胞质组分。去污剂有助于从胞质细胞器中提取蛋白质。
将裂解后的细胞悬液离心，并将上清液转移至新的离心管中。上清液含有细胞的胞质组分。为制备核组分，用完全裂解缓冲液重悬剩余的沉淀，并加入去垢剂。离心后，将存在于上清液中的核组分收集至微量离心管中。将胞质组分和核组分于-80摄氏度保存，以备后续分析。在以下实验方案中，我们将演示如何从白血病细胞中制备亚细胞组分。
刺激和/或药物处理孵育完成后，将细胞转移至分别标记的1.5毫升微量离心管中，在4摄氏度下以200 × g离心5分钟，形成细胞沉淀。弃去上清液后，用1毫升预冷的含磷酸酶抑制剂的PBS重悬细胞沉淀。在4摄氏度下以200 × g离心5分钟。移除上清液，并将所得全细胞提取物沉淀置于冰上，用于后续实验操作。
为制备细胞质组分，用50微升1×低渗缓冲液轻轻重悬细胞沉淀。将细胞置于冰上孵育15分钟，使其充分膨胀。在通过去垢剂梯度实验确定特定细胞类型所需的最佳去垢剂浓度后，向每个样品中加入0.8至2.5微升去垢剂，并在最高转速下涡旋振荡10秒。
为验证细胞裂解，需在加入去垢剂前后，于相差显微镜下观察细胞。所有细胞均具有致密且呈深色的细胞核，其周围为呈亮环状的细胞质。裂解完成后，在 4 摄氏度条件下，以 14,000 ×g 离心 30 秒。小心操作，避免扰动沉淀，将上清液转移至预冷并标记好的微量离心管中，并将此细胞质组分于 -80 摄氏度保存，直至进一步分析。
确保完全去除细胞质组分，以防止对细胞核组分造成污染。
向含有核组分的剩余沉淀中加入50 µL完整裂解缓冲液，通过上下吹打重悬。为溶解与核膜相关的蛋白质，加入2.5 µL去垢剂，最高速涡旋振荡10秒，冰上孵育30分钟。最高速涡旋振荡30秒后离心。然后将上清液转移至预冷并标记的微量离心管中，将此核组分于-80°C保存，直至进一步分析。