0 次观看 • 4:39 分钟 • April 30th, 2023
– 细胞外通量分析通过测量两种主要能量代谢途径——糖酵解和线粒体呼吸，来研究细胞代谢。在糖酵解过程中，细胞代谢葡萄糖并向细胞外空间分泌乳酸和质子，通过测定细胞外酸化速率（ECAR）来确定。在线粒体呼吸过程中，细胞利用氧气生成ATP，通过测定氧气消耗速率（OCR）来评估。
癌细胞表现出较高的葡萄糖摄取能力，因其改变了自身的代谢速率，以适应并维持不受调控的细胞增殖。为了分析癌细胞的代谢情况，首先需制备一块含有贴壁癌细胞单层及水化传感器 cartridge 的通量分析微孔板。将该微孔板组件转移至通量分析仪中。在分析仪内，传感器探针下降，形成一个瞬时的微室环境。为了测量细胞外通量，注射口会在预设的时间点将待测化合物注入微孔板中。
根据细胞代谢情况，微腔室中可用的氧气浓度和释放的质子浓度会发生波动。 cartridge 底部嵌入的两种荧光染料可同时感应并测量氧气和质子水平，分别反映线粒体呼吸和糖酵解情况。在以下实验方案中，我们将演示一种细胞外通量检测方法，用于测量原代白血病细胞的代谢活性。
— 同时，为准备用于细胞外通量分析的培养板，向两块8孔细胞外通量分析板的每孔中加入12.5 µL细胞粘附溶液。20分钟后，吸除细胞粘附液，并用200 µL无菌水洗涤每孔两次，每次洗涤使用200 µL无菌水。
第二次洗涤后，将酶标板留在通风橱中，直至孔内干燥，并将传感器盒倒置放在实验台上。分离通量分析仪的工具板和传感器盒，向工具板的每个孔中加入200 µL校准液，并向每个孔周围的外围沟槽中各加入400 µL校准液。
将传感器 cartridge 放回现在含有校准液的工具板中，并将 cartridge 组件置于加湿、37 °C、无 CO2 的培养箱中过夜。然后打开细胞外通量分析仪，使其在37 °C下过夜预热。
次日早晨，将细胞从培养瓶转移至50毫升锥形管中进行离心，并将沉淀重悬于1毫升适当的实验培养基中用于计数。将细胞以4 × 10⁶个细胞重悬于400微升实验培养基中，取50微升细胞悬液加入Flux分析仪板的B至G孔，同时在A孔和H孔中各加入180微升实验培养基作为背景对照孔。
离心后，缓慢而小心地向 B 至 G 孔中各加入 130 微升实验培养基，并在显微镜下观察确认细胞稳定贴附于各孔底部。随后将代谢通量分析板放回无 CO2 的湿润、37 摄氏度培养箱中孵育 30 分钟。
孵育结束前20分钟，根据实验方案和表格中的指示，将化合物加入到 cartridge 相应的加样端口。然后设置合适的细胞外通量分析程序。启动程序，并在系统提示时将校准板更换为检测板。