0 次观看 • 3:57 分钟 • April 30th, 2023
- T细胞是一类淋巴细胞，在抵抗感染中发挥重要作用。与其他多种血细胞一样，具有免疫活性的T细胞存在于小鼠的脾脏和淋巴结中。为选择性分离T细胞，可取小鼠脾脏和淋巴结组织，并在细胞筛上进行研磨。用适当的培养基冲洗组织，以获得单细胞悬液。
加入氯化铵钾（ACK）缓冲液以裂解红细胞。离心分离完整的血细胞与裂解物。弃去上清液，并将细胞重悬于适当的缓冲液中。用生物素标记的抗小鼠抗体混合物处理细胞悬液，以靶向粒细胞、B细胞、NK细胞以及任何残留的红细胞。T细胞不会被靶向，因此保持未标记状态。
接下来，向悬液中加入抗生物素磁性微珠。所有生物素标记的细胞都会与微珠结合。在强磁场作用下，磁性标记的细胞会吸附在管壁上，而未标记的T细胞则保留在悬液中。将未结合的、富集的T细胞收集到新的收集管中。在接下来的实验方案中，我们将展示利用磁性分离技术从小鼠脾脏和淋巴结中分离T细胞的方法。
— 将淋巴结和脾脏汇集于一个40微米孔径的细胞筛中，使用注射器活塞碾磨组织，使细胞通过滤膜释放。用添加了1%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基冲洗细胞筛和活塞，以收集全部细胞，并通过离心沉淀细胞。向细胞沉淀中加入5毫升ACK裂解缓冲液。
室温孵育5分钟后，加入5毫升含1% FBS的培养基终止反应，并通过离心收集白细胞。将细胞沉淀重悬于5毫升MACS缓冲液中进行计数，并用新鲜MACS缓冲液将细胞稀释至浓度为2 × 10⁸ 个细胞/微升。每1 × 10⁶ 个细胞加入适量浓度的抗红系、抗粒细胞、抗B细胞和抗NK细胞耗竭抗体，在4°C孵育15分钟。
孵育结束后，用10毫米的预冷MACS缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于新鲜MACS缓冲液中，浓度为每毫升1×10⁸个细胞。接着，每1×10⁶个细胞加入0.22微升抗生物素微珠，混匀后于4摄氏度孵育15分钟。
孵育结束后，用10毫升预冷的MACS缓冲液洗涤细胞，并根据标准磁珠分离方案，使用MACS express分离器通过磁珠分离法收集未结合的富集T细胞。分离结束后，通过离心沉淀T细胞，并将沉淀重悬于5毫升新鲜MACS缓冲液中用于计数。